1 Metody detekcji i identyfikacji bakteriiDorota Żabicka Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej Narodowy Instytut Leków Warszawa

2 Budowa komórki bakteryjnej

3 Badanie mikrobiologiczneCel: identyfikacja czynnika etiologicznego zakażenia i oznaczenie wrażliwości na antybiotyki Tok badania mikrobiologicznego Pobranie materiału Badanie materiału: Metody klasyczne Badanie mikroskopowe Hodowla i identyfikacja drobnoustroju Oznaczenie wrażliwości bakterii na antybiotyki Metody immunologiczne Metody molekularne

4 Pobieranie i przesyłanie materiałuRodzaj podłoża transportowego i rodzaj pojemników są dostosowywane do rodzaju materiału i kierunku badania (bakterie, wirusy, obecność przeciwciał)

5 Badanie mikroskopowe Mikroskop świetlny Preparaty barwionemetoda Grama metody specjalne np. barwienie na obecność zarodników Laseczka tężca Clostridium tetani, zarodniki na końcu komórki bakteryjnej nadające kształt pałeczki dobosza

6 Ściana komórkowa bakteriiBakterie Gram-dodatnie Bakterie Gram-ujemne

7 Badanie mikroskopowe Neisseria meningitidisPreparat z osadu płynu mózgowo-rdzeniowego barwiony metodą Grama Cryptococcus neoformans Preparat tuszowy z osadu płynu mózgowo-rdzeniowego

8 Badanie mikroskopowe Preparat z ciemnym polem widzenia (Treponema pallidum) Mikroskop fluorescencyjny

9 Badanie mikroskopowe Mikroskop kontrastowo-fazowy grzyby z rodzaju Candida

10 Badanie mikroskopowe Mikroskop elektronowy

11 Hodowla bakterii Stosowane podłoża bakteriologiczne płynne i stałeHodowla prowadzona w warunkach najbardziej odpowiednich dla poszukiwanych drobnoustrojów Czas hodowli od kilku godzin (np. pałeczki okrężnicy czyli Escherichia coli) do kilkunastu dni (np. prątki gruźlicy czyli Mycobacterium tuberculosis)

12 Wymagania wzrostowe bakteriiZapotrzebowanie na tlen Tlenowe – O2 Beztlenowe – mniej niż 1-0,5% O2 Mikroaerofilne – mieszanina 5% O2, 10% CO2, 85% N2 Źródło węgla Autotroficzne – CO2 Heterotroficzne – aminokwasy, peptydy, cukry, lipidy Pozostałe związki niezbędne do wzrostu Sole nieorganiczne Witaminy

13 Czynniki fizykochemiczneTemperatura Psychrofile – optimum 0-10C Mezofile – optimum 20-40C Termofile – optimum 50-60C pH Większość bakterii preferuje neutralne wartości pH ~ 7.0 Ciśnienie osmotyczne Wiekszość preferuje aw ~ 0,99

14 Wzrost hodowli bakterii w podłożu płynnym

15 Hodowla i identyfikacja drobnoustrojówPodłoże agarowe wzbogacone krwią – widoczna strefa hemolizy dookoła kolonii

16 Hodowla i wstępna identyfikacja drobnoustrojówCPS Podłoża wybiórcze, wybórczo-różnicujące chromogenne i specjalne MacConkey agar

17 Oznaczanie mechanizmów oporności na antybiotyki – podłoża chromogenneMRSA ESBL VRE

18 Hodowla i identyfikacja drobnoustrojówIdentyfikacja drobnoustrojów z zastosowaniem testów wykonywanych na płytkach wrażliwość na bacytracynę test CAMP

19 Hodowla i identyfikacja drobnoustrojówIdentyfikacja drobnoustrojów z zastosowaniem zestawów probówkowych gotowych testów identyfikacyjnych

20 Systemy automatyczne Systemy automatyczne stosowane są do hodowli drobnoustrojów (np. Bactec do posiewów krwi) lub do identyfikacji i oznaczenia lekowrażliwości wyhodowanych wcześniej na podłożach stałych drobnoustrojów VITEK 2 Compact BioMerieux Phoenix BD Diagnostic Systems

21 System VITEK 2 Compact System automatyczny do identyfikacji i oznaczenia lekowrażliwości drobnoustrojów wyhodowanych wcześniej na podłożach stałych

22 Oznaczenie lekowrażliwości drobnoustrojówOznaczanie metodą rozcieńczeniową Gotowe testy diagnostyczne do odczytu manualnego Oznaczanie za pomocą systemów automatycznych

23 Oznaczanie lekowrażliwości i mechanizmów oporności na antybiotykiDyfuzja z paska Dyfuzja z krążka Szczep gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus) oporny na wszystkie antybiotyki -laktamowe (MRSA) Podłoże z antybiotykiem

24 Metody immunologiczneTesty lateksowe, ELISA, immunofluorescencyjne wykrywające całe komórki lub antygeny bakterii (białka powierzchniowe, wielocukry otoczkowe, toksyny) Pozwalają wykryć bakterie w materiale pobranym od chorego lub pomagają w identyfikacji wyhodowanych bakterii Stosowane gotowe testy manualne lub automatyczne Aglutynacja lateksowa

25 Metody immunologiczne - EIA

26 Metody immunologiczne – systemy automatyczneSystem VIDAS

27 Nowe metody oparte o metody immunologiczne

28 Spektrometria MALDI-TOF

29 Spektrometria MALDI-TOF

30 Spektrometria MALDI-TOF

31 Metody molekularne Stosowane głównie metody oparte o reakcje PCR lub real-time PCR Dostępne różne gotowe testy komercyjne w dwóch wariantach Zestaw odczynników do wykrywania bakterii, reakcja w dowolnym aparacie do PCR lub real-time PCR Zestawy odczynników lub zamknięte systemy diagnostyczne przeznaczone do użycia w aparacie określonej firmy Testy zarówno do wykrycia bakterii np. M.tuberculosis jak i identyfikacji ważnych epidemiologicznie bakterii np. MRSA lub wykrycia toksyn bakteryjnych

32 Genom bakteryjny Chromosom bakteryjny o różnej wielkości w zależności od gatunku bakterii oraz obecności wbudowanych elementów ruchomych (plazmidów, transpozonów, bakteriofagów)

33 Metoda PCR

34 Metoda PCR 6 1 8 / 9 7 5 A T C 4 3 2 R u l e r DNA mecA ok. 550 kb1 8 / 9 7 5 A T C 4 3 2 R u l e r DNA mecA ok. 550 kb mecA gen występujący u MRSA

35 Real-time PCR Krzywe reakcji real-time PCR

36 Szybkie testy molekularne np. GeneXpert

37 Sondy typu Scorpion Dwa rodzaje sond typu Scorpion stosowane w testach z serii GeneXpert rysunki: źródło Cepheid

38 Zintegrowana kontrola wewnętrzna w mieszaninie reakcyjnejMg2+ Taq DNA Polymerase target scorpion IC scorpion dCTP dGTP Internal Control (IC) dUTP dATP rysunki źródło Cepheid

39 Mikromacierze

40 Bakteriofagi – wirusy bakteryjne

41 Bakteriofagi - morfologia

42 Bakteriofagi – cykle życiowe

43 Bakteriofagi – zastosowanie w diagnostyceTypowanie bakterii w celu określenia pokrewieństwa izolowanych szczepów łysinka

44 Bakteriofagi – zastosowanie w detekcji i identyfikacji bakterii

45 Bakteriofagi – zastosowanie w detekcji i identyfikacji bakterii

46 Bakteriofagi – zastosowanie w detekcji i identyfikacji bakterii

47 Dziękuję za uwagę