1 Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerówCzęść 3: Badania strukturalne oligonukleotydów

2 Budowa kwasów nukleinowych – schemat ogólnyzasada azotowa zasada azotowa zasada azotowa 5' cukier 3' fosforan 5' cukier 3' fosforan 5' cukier 3' 5' koniec 3' koniec

3 Budowa kwasów nukleinowychczęść cukrowa – struktury zasada 2'-deoksyryboza ryboza

4 Budowa kwasów nukleinowych część cukrowa – przesunięcia chemiczne1H [ppm] DNA RNA G A C T G A C U H1' H2' H2'' H3' H4' H5' H5'' 13C [ppm] DNA RNA C1' C2' C3' C4' C5'

5 Budowa kwasów nukleinowych zasady azotowe – strukturyA, G – puryny C, T(U) - pirymidyny tymina cytozyna uracyl guanina adenina

6 Budowa kwasów nukleinowych zasady azotowe – przesunięcia chemiczne 1Hzasada niewymienialne wymienialne T H(6) NH (3) 13-14 CH3(5) U H(5) NH(3) 13-14 H(6) C H(5) NH2(4) / H(6)   A H(2) NH2(6) 5-6 / 7-8  H(8) G H(2) NH(1) H(8) NH2(2) 5-6 / 8-9

7 Budowa kwasów nukleinowych zasady azotowe – przesunięcia chemiczne 13C i 15N DNA RNA G A C T G A C U N C N C C C N C N NH

8 Budowa kwasów nukleinowych sprzężenia spinowecukier 1J(C1’H1’) 1J( C2’H2’) 1J( C3’H3’) 1J( C4’H4’) 1J( C5’H5’) 1J( C5’H5’’) zasada azotowa imina 1J(NH) 1J(CH) 1J(C8N9) 1J(C8N7) 1J(C6N1) cukier – zasada 1J(C1’N1) 1J(C1’N9)

9 Komplet sprzężeń 1J w guaniniecalc GTP exp C8-H8 210.0 216.3 N2-H2 -93.3 -91.7 -90.1 C4-C5 57.6 63.5 C4-N9 -19.8 -19.2 C5-C6 96.6 87.9 C5-N7 6.8 4.1 C6-N1 -2.0 -5.9 C8-N9 nakład C8-N7 -8.7 K. Ruszczyńska et al., Biophysical Journal, 85, 1450 (2003).

10 Struktura drugorzędowa kwasów nukleinowych

11 Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych dwuniciowe helisyB Z B: typowa dla dwuniciowego DNA w komórkach A: dwuniciowy RNA i DNA+RNA Z: obszary DNA posiadające naprzemiennie puryny i pirymidyny; np. 5'-CGCGATCG-3'

12 Struktury przestrzenne kwasów nukleinowychtrypleksy tetrapleksy

13 Motywy drugorzędowe struktury RNAStruktury przestrzenne kwasów nukleinowych Motywy drugorzędowe struktury RNA Rodzaje RNA rybosomalny (rRNA) matrycowy (mRNA) transportujący (tRNA) niekodujący (ncRNA) Struktury RNA

14 Przypomnienie Ogólna strategia wyznaczania struktur białek 1) Przypisanie sygnałów. 2) Identyfikacja więzów. 3) Generowanie struktur spełniających więzy doświadczalne. Postępowanie w punktach 1 i 2 zależy od wielkości badanego białka lub kompleksu białkowego. Postępowanie w punkcie 3 zależy od rodzajów i liczby dostępnych więzów.

15 Ogólna strategia wyznaczania struktur kwasów nukleinowych1) Przypisanie sygnałów. 2) Identyfikacja więzów. 3) Generowanie struktur spełniających więzy doświadczalne. Postępowanie w punktach 1 i 2 zależy od wielkości badanego kwasu nukleinowego. Postępowanie w punkcie 3 zależy od rodzajów i liczby dostępnych więzów.

16 RNA - 34 nt; typowe widmo 1H NMRH2',H3',H4',H5',H5'' H2,H6,H8,NH2 H5,H1' NH

17 DNA - 20 nt; typowe widmo 1H NMRróżnice względem RNA: H2',H2'' oddzielone; CH3(T)

18 Przypisanie sygnałów: RNA - korelacje H1'/H2'

19 Przypisanie sygnałów: RNA – korelacje H1'/C1'20-nt RNA, naturalna zawartość 13C, 30 oC

20 Przypisanie sygnałów: RNA –korelacje H2'/C2'…H5'H5''/C5'

21 Przypisanie sygnałów: DNA – korelacje H2/H7 w tyminach

22 Przypisanie sygnałów: korelacje H5/H6w cytozynach i uracylach

23 Przypisanie sygnałów: korelacje C5/H5w cytozynach i uracylach

24 Przypisania sekwencyjne: korelacje 1H/31P

25 800 MHz, m=300ms, 100% 2H2O, 25°C H1' / H5 (ppm)Przypisania sekwencyjne: RNA – korelacje H5/H1' A A G A 15 2D NOESY C G G1 U A 20 G C G C A 10 A U U U 25 G C C33 H2 / H6 / H8 (ppm) A U U G G C 5 2.45 Å C26 H5-H6 G C 30 A U G C G C 5’ 3’ 800 MHz, m=300ms, 100% 2H2O, 25°C H1' / H5 (ppm)

26 Przypisania sekwencyjne: RNA – korelacje H6,H8/H1'20 nt RNA, NOESY

27 Przypisania sekwencyjne: DNA – korelacje H6,H8/H1'27 nt DNA, NOESY

28 Inne możliwe przypisania sekwencyjne: DNA i RNAH6,H8/H2' H6,H8/H2' H6,H8/H2'' 2H6,H8/H3' H6,H8/H4'

29 Przypisania sekwencyjne: korelacje protonów iminowych (tylko G i T/U)U20G21 G19 A22 G18 – C23 G17 – C24 C16 – G25 A15 – U26 U13 C14 – G27 C12 C11 U10 U9 A8 C7 – G28 A6 – U29 G5 – C30 G4 – C31 A3 – U32 G2 – C33 G1 – C34

30 Przypisania w oligonukleotydach znakowanychcukry 3D HCCH-COSY 3D HCCH-TOCSY zasady 3D HbCbNb H6-C6-N1 H8-C8-N9

31 Przypisania w oligonukleotydach znakowanych : cukier - zasada3D HCN lub 2D H(C)N H1'-C1' -N1/N9

32 Przypisania w oligonukleotydach znakowanych : cukier - zasada2D H(C)N

33 1hJNH Więzy wiązań wodorowych – parowanie zasad 2JNN 2D H(N)N-COSY2 – 4 Hz 6 – 7 Hz 2JNN 2D H(N)N-COSY

34 Parowanie zasad 10 2D HNN-COSY 2D NOESY N1 N3 15N (ppm) N3 1H (ppm) N1800 MhHz, 95% H2O, 5°C H (ppm) 10 800 MHz, 95% H2O, 5°C H (ppm)

35 Powody, dla których dotychczas wyznaczono niewiele struktur oligonukleotydówDNA mało interesujące – podwójna helisa, parowanieW-C RNA – interesujące, ale znacznie trudniejsze: widma trudniejsze w interpretacji – degeneracja przesunięć chemicznych w cukrach, trudne w otrzymywaniu: trzeba dysponować znakowanymi trójfosforanami rybonukleotydów, matrycą DNA i polimerazą RNA; niska wydajność, bardzo trudne w utrzymaniu: rozkład powodują ślady metali, nukleazy, autoliza i znikają