1 Cykl Kwasów Tri-karboksylowych = TCA = Cykl Krebsa = Cykl Kwasu Cytrynowego

2 Miejsce cyklu Krebsa na mapie metabolicznej

3 Uproszczony schemat cyklu Krebsa(8 etapów)

4

5

6 Dwie drogi wejścia pirogronianu do cyklu kwasów trikarboksylowych (wątroba)Szczawiooctan Acetylo-CoA

7 Karboksylaza pirogronianowaKarboksylaza pirogronianowa używa kowalencyjnie przyłączonej biotyny jako kofaktora dwuetapowej reakcji karboksylacji pirogronianu. Biotyna jest najpierw łączona z CO2 pochodzącym od węglanu, (przy zużyciu ATP). Grupa karboksylowa jest następnie przenoszona przez karboksybiotynę na drugie miejsce katalityczne, gdzie pirogronian jest przekształcany w szczawiooctan.

8 Reakcja katalizowana przez dehydrogenazę pirogronianową

9 Kompleks dehydrogenazy pirogronianowej składa się z trzech białek o różnych aktywnościach. Zwróć uwagę na 5 różnych kofaktorów tego złożonego procesu. Pirogronian Acetylo-CoA

10 Kwas Liponowy pełni tu funkcję ramienia przenoszącego pozostałą po dekarboksylacji pirogronianu resztę hydroksyetylową, pomiędzy podjednostkami E1 i E3, katalizującymi kolejne etapy reakcji fragment pirgronianu Utleniony Liponian Tiamina

11 Syntaza Cytrynianowa Cytrynian powstaje w reakcji katalizowanej przez syntazę cytrynianową ze szczawiooctanu i acetylo-CoA. Mechanizm polega na ataku nukleofilowym karboanionu acetylo-CoA na węgiel karbonylowy szczawiooctanu, po czym dochodzi do hydrolizy wiązania tioestrowego.

12 Reakcje katalizowane przez Akonitazę-H2O + H2O Kwas Cytrynowy Kwas akonitowy Kwas izocytrynowy Akonitaza (Hydrataza akonitanowa; EC ) jest enzymem katalizującym stereo-specificzną izomeryzację cytrynianu do izocytrynianu poprzez związek pośredni – kwas cis-akonitowy.

13 Kofaktorem Akonitazy jest zespół Fe3S4

14 Akonitaza (kont.) Reakcja netto nie jest typu redoksowego!Akonitaza zawiera zespół żelazowo-siarkowy złożony z trzech atomów żelaza i czterech atomów siarki, ułożonych w strukturę bliską kubicznej. Zespół ten jest umocowany w białku przez grupy tiolowe trzech reszt cysteiny. Brak mu jednego z narożników sześcianu. W tym właśnie miejscu wiązany jest jon F2+, odpowiedzialny za aktywację akonitazy. Ten atom koordynacyjnie wiąże C-3 karboksylu oraz grupę hydroksylową cytrynianu. Działa więc jako kwas Lewisa: przyłączając parę elektronów grupy hydroksylowej, ułatwia odłączenie całej reszty. Reakcja netto nie jest typu redoksowego!

15 Dehydrogenaza Isocytrynianowa (pierwsza reakcja redoksowa cyklu)Dehydrogenaza Isocytrynianowa (IDH) jest enzymem cyklu pośrednio współdziałającym z łańcuchem oddechowym.  Jest odpowiedzialna za odwracalne przekształcanie izocytrynianu w -ketoglutaran i CO2, w dwuetapowej reakcji.  Pierwszym etapem jest utlenienie izocytrynianu do szczawiobursztynianu.  W drugim etapie reakcji szczawiobursztynian traci swój -karboksyl jako CO2 .

16 Tlenowa dekarboksylacja -ketoglutaranu

17 Kompleks dehydrogenazy -ketoglutaranowej-Ketoglutaran jest oksydacyjnie dekarboksylowany do bursztynylo-CoA przez dehydrogenazę -ketoglutaranową. W tej reakcji powstaje druga już cząsteczka CO2 cyklu Krebsa, oraz cząsteczka NADH. Ten kompleks wielo-enzymatyczny jest bardzo podobny do kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej zarówno pod względem składu białkowego, rodzaju kofaktorów, jak i mechanizmu działania. Tak samo jak PDH, reakcja  -KGDH przebiega z wysoką standardową zmianą energii swobodnej Gibbsa. Reakcja jest regulowana proporcjami stężeń NAD+/NADH oraz ATP/ADP.

18 Reakcja i kofaktory tlenowej dekarboksylacji -ketoglutaranu

19 Tiokinaza bursztynianowa (reakcja)

20 Tiokinaza bursztynylowa (Syntetaza bursztynylo - CoA)Konwersja wysokoenergetycznego bursztynylo-CoA do wolnego bursztynianu biegnie z udziałem enzymu zdolnego do syntezy wysokoenergetycznego nukleotydu trifosforanowego. Taki proces zwiemy fosforylacją substratową. Powstaje wtedy połączenie enzym -wysokoenergetyczny związek pośredni. Dopiero z niego „wysoko energetyczna reszta fosforanowa” jest przenoszona na GDP. Powstały w ten sposób mitochondrialy GTP podlega trans-fosforylacji katalizowanej przez nukleozydo-difosfo-kinazę z cząsteczką ADP, i wytworzenie ATP. Cząsteczka GTP jest odtwarzana potem w kolejnym obrocie cyklu.

21 Dehydrogenaza Bursztynianowa (SDH)Katalizuje utlenienie bursztynianu do fumaranu z równoczesną redukcją kowalencyjnie związanego z białkiem FAD, oraz żelaza niehemowego. W komórkach ssaków końcowym akceptorem elektronów jest koenzym Q.

22 Dehydrogenaza bursztynianowa (SDH, Kompleks II)Skład: Cztery podjednostki białkowe (A,B,C,D) oraz następujące przenośniki elektronów: FADH2, zespoły Fe-S, hem b560, ubichinon.

23 Fumaraza (hydrataza fumaranowa)Katalizuje katalizuje uwodnienie fumaranu do kwasu jabłkowego.

24 Dehydrogenaza jabłczanowa (MDH)Katalizuje odwracalną reakcję utlenienia jabłczanu do szczawiooctanu przy standardowej zmianie energii swobodnej około +7 kcal/mol. Natomiast syntaza cytrynianowa, katalizująca reakcję kondensacji acetylo-CoA ze szczawiooctanem, zachodzi przy standardowej wielkości g równej około -8 kcal/mol. Zatem to ten enzym „ciągnie” reakcję MDH w kierunku szczawiooctanu.

25 Reacja dehydrogenazy jabłczanowej

26 Sumaryczne równanie cyklu kwasów trikarboksylowych:Acetylo-CoA + 3NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2H2O 2CO2 + 3NADH + FADH2 + GTP + 2H+ + HSCoA

27 Energetyka cyklu Krebsa w sprzężeniu z łańcuchem oddechowymEnergetyka cyklu Krebsa w sprzężeniu z łańcuchem oddechowym. Obliczanie energii zmagazynowanej w postaci ATP W całym cyklu są: 3 utlenienia z NAD 1 utlenienie z FAD 1 fosforylacja substratowa Produkcja ATP sprzężona z tymi procesami wynosi odpowiednio: 3 x 2,5 = 7,5 cząsteczek ATP 1 x 1,5 = 1,5 cząsteczek ATP 1 x 1 = 1 GTP (= 1 cząsteczka ATP) W sumie = 10 cząsteczek ATP (utworzone z ADP) przy spaleniu jednej reszty octanowej do H2O i CO2 Jest to równoważne 310 kJ w warunkach standardowych.

28 Cykl kwasów trikarboksylowych jest przemianą amfiboliczną, czyli zarówno:Kataboliczną jak i Anaboliczną

29 Związki z wielu przemian są katabolizowane lub przekształcane w cyklu cytrynianowym

30 Cykl cytrynianowy jako źródło prekursorów szlaków biosyntezy

31 Regulacja cyklu cytrynianowegoRegulacja tego cyklu odbywa się zarówno na wejściu jak i na poziomie samego cyklu. „Paliwo” dla tej przemiany wchodzi głównie pod postacią acetylo-CoA. Pochodzi on ze wszystkich trzech szlaków katabolicznych: lipidów, węglowodanów, aminokwasów. Jednak najistotniejszym jest źródło węglowodanowe, czyli kompleks dehydrogenazy pirogronianowej. PDH jest hamowana przez wysokie stężenia acetylo-CoA i NADH, aktywowana przez wolny CoA (CoASH) and NAD+. Mechanizm tej regulacji polega na użyciu odpowiedniej kinazy i fosfatazy. Fosforylacja PDH hamuje aktywność kompleksu, prowadząc do obniżenia tempa utleniania pirogronianu. PDH kinaza jest aktywowana przez NADH i acetyl-CoA, a hamowana przez pirogronian, ADP, CoASH, Ca2+ i Mg2+. PDH fosfataza, jest aktywowana jonami Mg2+ i Ca2+.