1 Mikroskopia i techniki wizualizacjiMilena Damulewicz Zakład Cytologii i Histologii Uniwersytet Jagielloński
2
3
4
5 http://www. microscopy. fsu
6 optyka
7 http://www. microscopy. fsu
8
9 http://www. microscopy. fsu ABERRACJA SFERYCZNA Wiązki światła symetryczne względem osi optycznej i różnie od niej oddalone, po przejściu przez układ nie przecinają się w jednym punkcie
10 ABERRACJA CHROMATYCZNA ABERRACJA CHROMATYCZNA Wada soczewkowych układów optycznych spowodowana zależnością współczynnika załamania światła materiału soczewek od długości fali świetlnej; przejawia się w powstawaniu na obrazie barwnych obwódek wskutek rozszczepienia światła przy załamaniu w materiale soczewki.
11 http://www. microscopy. fsu. edu/primer/java/aberrations/coma/index KOMA Wiązka promieni świetlnych, wychodząca z punktu położonego poza osią optyczną, tworzy po przejściu przez układ plamkę w kształcie przecinka; ujawnia się tym bardziej, im dalej punkt leży od osi.
12 http://www. microscopy. fsu Astygmatyzm Obraz punktu położonego poza osią optyczną układu nie tworzy punktu, lecz dwie linie ogniskowe, z których jedna leży w płaszczyźnie padania, obejmującej oś soczewki i przedmiot punktowy, a druga jest do tej płaszczyzny prostopadła.
13 http://www. microscopy. fsu
14 http://www. microscopy. fsu
15
16 Zdolność rozdzielcza mikroskopuNA NA = n sinm
17
18
19 L – mechaniczna długość tubusaPowiększenie mikroskopu L D M = f1 f2 L – mechaniczna długość tubusa D – odległość dobrego widzenia (250 mm) f1 – ogniskowa obiektywu f2 – ogniskowa okularu
20 Przysłona aperturowa
21 Typy mikroskopów Mikroskop świetlny Fluorescencyjny ElektronowyJasnego pola Ciemnego pola Kontrastu fazowego Interferencyjny Polaryzacyjny Fluorescencyjny Elektronowy Skaningowy transmisyjny Konfokalny
22 Mikroskop jasnego i ciemnego pola
23 Mikroskop interferencyjnyKontrast Nomarskiego Analiza ilościowa suchej masy Określenie grubości skrawków Optyczne „wybarwienie” Plastyczny obraz
24 Mikroskop fluorescencyjnyFiltr wzbudzenia Filtr absorbujący Filtr barierowy
25 Mikroskop konfokalny
26 Mikroskop elektronowy skaningowy
27 TEM
28 Metody wizualizacji Barwienie przyżyciowe Barwienie histologiczneBarwienie histochemiczne Barwienie immunohistochemiczne Barwienie fluorescencyjne Barwienie immunofluorescencyjne Barwienie radioimmunoizotopowe Barwienie enzymatyczne GFP
29 Przygotowanie materiałuPreparaty parafinowe Utrwalenie tkanek – formalina Odwodnienie Przepojenie Zatopienie w parafinie Skrawanie Odparafinowanie Nawodnienie barwienie Preparaty mrożeniowe Krioprotekcja Utrwalenie w ciekłym azocie Skrawanie barwienie
30 Barwienie histologiczneKontrastowanie struktur komórkowych Hematoksylina + eozyna fiolet krystaliczny
31 Barwienie histochemiczneUwidocznienie określonych substancji w komórce PAS = z odczynnikiem Schiffa – wykrywa cukry
32 Barwienie immuno- Przeciwciało drugorzędowe znacznik PrzeciwciałoPrzeciwciało pierwszorzędowe
33 Barwienie immunohistochemiczneWykrywanie antygenów za pomocą znakowanych przeciwciał
34 Barwienie radioimmunoizotopoweTryt Jod 125 Fosfor 32 Fosfor 33 Siarka35 Węgiel 14
35 Barwienie enzymatycznePeroksydaza chrzanowa Alkaliczna fosfataza
36 Barwienie fluorescencyjneDiIC18 – błona komórkowa Hoechst –DNA – niebieskie DAPI Oranż akrydyny – DNA zielone; RNA pomarańczowe
37 Barwienie immunofluorescencyjneFITC Texas red Cy3 rodamina
38 GFP
39 Oświetlenie Kohlera Kondensor przesuwamy pod stolikUstawiamy ostro widziany preparat Zamykamy przesłonę polową i aperturową Ustawiamy na środku plamkę światła Ustawiamy ostre brzegi plamki Rozszerzamy plamkę do granic pola widzenia Ustawiamy włókna żarówki centralnie