1 Modificación de los genomas para su aplicación en biotecnología alimentariaR. Osta
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3 Animal transgénico para la Esclerosis Lateral AmiotróficaIntroducción 1/68
4 ¿ Qué son los organismos modificados genéticamente?(Directiva 90/220/CEE) Cualquier organismo cuyo material genético ha sido modificado de una manera que no se produce de forma natural en el apareamiento o en la recombinación natural. En la mayoría de los casos, la causa es desconocida pero existen muchas teorías propuestas para tratar de explicar por qué ocurre la enfermedad, como por ejemplo, ….. Es probable que no sea única la causa, sino una combinación de varios mecanismos, que tienen como vía final común la muerte de MNs. Definición 4/68
5 - Modificación genética en organismos unicelulares ¿Qué vamos a tratar?. - Modificación genética en organismos unicelulares -Modificación genética en organismos pluricelulares. - Aplicaciones de esta metodología y clonación. Indice 6/68
6 Modificación de organismos unicelulares: bacterias y levaduras. Figura 1 Esquema de mejora genética de levaduras vínicas mediante el uso de técnicas de DNA recombinante Figura 1 Esquema de mejora genética de levaduras vínicas mediante el uso de técnicas de DNA recombinante ¿Si vemos un video? Modificación de organismos unicelulares: bacterias y levaduras. Modificación genética en organimso unicelulares 6/68
7 Pero ,¿qué necesitaremos recordar?Introducción Definición 2/68
8 Estructura de un gen Intrones Exones PROMOTOR RNA (cDNA) PROTEÍNAEn la mayoría de los casos, la causa es desconocida pero existen muchas teorías propuestas para tratar de explicar por qué ocurre la enfermedad, como por ejemplo, ….. Es probable que no sea única la causa, sino una combinación de varios mecanismos, que tienen como vía final común la muerte de MNs. PROTEÍNA Introducción 3/68
9 Al azar TRANSGÉNESIS Recombinación homóloga Tipos de transgénesis 5/68
10 TRANSGÉN GEN GENOMA Tipos de transgénesis 6/68
11 Al azar TRANSGÉN Concatémeros Gen crucial GEN Zonas metiladasTipos de transgénesis 6/68
12 Recombinación homóloga TRANSGÉN GEN TRANSGÉN Tipos de transgénesis
13 ¿De qué constará el ADN que queremos insertar?Expresión Localización de la expresión Regulación de la expresión. cDNA, DNA genómico. Promotor. Enhancer, elementos cis y trans. Transgénesis al azar 6/68
14 Transgén simple Promotor as1-antitripsina b-lactoglobulina humanabovina as1-antitripsina humana Transgénesis al azar 6/68
15 ¿Por qué no lo pones en la pizarra que nos enteraremos más?Transgénesis al azar
16 Términos utilizados Knock-out: (fuera de combate) Knock-in:Animal creado mediante recombinación homóloga para evitar la expresión de un gen. Knock-in: Animal creado mediante recombinación homóloga para que un gen se exprese bajo el promotor que deseemos. Transgénesis por recombinación homóloga
17 ¿De qué consta una construcción para la recombinación homológa?-Zona homólogas al gen de interés. -Resistencia a antibióticos/mismo gen: - Kanamicina (procariotas) - Neomicina (eucariotas) Knock-out Knock-in -Opcional: - Gen marcador - Gen de expresión. Transgénesis por recombinación homóloga
18 Recombinación homólogaGENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO Promotor p DNA M Gen marcador R Resistencia CONSTRUCCIÓN GENÉTICA Transgénesis por recombinación homóloga
19 Recombinación homólogaGENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO DNA M Gen marcador R Resistencia Promotor p CONSTRUCCIÓN GENÉTICA Transgénesis por recombinación homóloga
20 Recombinación homólogaGENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO DNA M Gen marcador R Resistencia Promotor p CONSTRUCCIÓN GENÉTICA Transgénesis por recombinación homóloga
21 MODOS DE INTRODUCCIÓN DEL TRANSGEN
22 IN VIVO IN VITRO DIRECTAMENTE EN EMBRIÓN.REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARES IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES Modos de introducción del transgen
23 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - MicroinyecciónDIRECTOS INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES Modos de introducción del transgen
24 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - MicroinyecciónDIRECTOS INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES Modos de introducción del transgen
25 ESPERMATOZOIDES Esponda, P. C.B.I. y C.S.I.CModos de introducción del transgen
26 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - MicroinyecciónDIRECTOS INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES Modos de introducción del transgen
27 Biolística o método de bombardeo.Modos de introducción del transgen
28 HA SIDO MUY UTILIZADA EN PLANTASBiolística o método de bombardeo. Partículas de tungsteno u oro Descarga con helio. Características: Capacidad de introducción limitada. HA SIDO MUY UTILIZADA EN PLANTAS Modos de introducción del transgen
29 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - MicroinyecciónDIRECTOS INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES Modos de introducción del transgen
30 MICROINYECCIÓN Microinyección en el pronúcleo masculino.Microinyección en el citoplasma del huevo. Añaden protección al DNA (polilisinas, etc.) Modos de introducción del transgen
31 ¿Qué necesitamos para realizar la microinyección?Transgen Cigotos Introducir el transgén en el cigoto Desarrollar el embrión Construcción al azar. Animales donadores. Micromanipulador. Madres receptoras Modos de introducción del transgen
32 ¿Como consigo los cigotos?Ovulación cíclica y corta (ratón, rata). Machos y hembras donadoras Hembras receptoras y machos vasectomizados Otras especies Tratamientos hormales en las hembras. Hembras donadoras y receptoras y machos.
33 Micromanipulador Modos de introducción del transgen
34 Micromanipulador Modos de introducción del transgen
35 Micromanipulador Modos de introducción del transgen
36 Pronúcleo masculino Modos de introducción del transgen
37 En animales domésticos (sobre todo en laespecie porcina) es necesario centrifugar el huevo debido al vitelo. Modos de introducción del transgen
38 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - MicroinyecciónDIRECTOS - Bacterias/Virus - Liposomas INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES Modos de introducción del transgen
39 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - MicroinyecciónDIRECTOS - Bacterias/Virus - Liposomas INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES Modos de introducción del transgen
40 Agrobacterium tumefaciens con gen de interes DNA de la planta Co-cultivo 48 horas 22ºC Formación de callos Aislamiento de posibles plantas transformadas DNA insertado en el genoma Pruebas genéticas que permitan controlar la inserción del gen Modos de introducción del transgen
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42 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - MicroinyecciónDIRECTOS - Bacterias/Virus - Liposomas INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES Modos de introducción del transgen
43 LIPOSOMAS CATIÓNICOS pH SENSIBLE O ANIÓNICOSu carga positiva reacciona con la negativa del DNA formando un complejo. pH SENSIBLE O ANIÓNICO Mediante una desestabilización por bajo pH el DNA entra en “núcleo del liposoma”. Modos de introducción del transgen
44 MÉTODOS “IN VITRO” (Cultivos celulares)Las células modificadas genéticamente deberán ser introducidas posteriormente en el embrión u óvulo Modos de introducción del transgen
45 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - MicroinyecciónDIRECTOS - Bacterias/Virus - Liposomas INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES Modos de introducción del transgen
46 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - MicroinyecciónDIRECTOS - Bacterias/Virus - Liposomas INDIRECTOS IN VITRO Precipitación con fosfato de calcio QUÍMICOS FÍSICOS Modos de introducción del transgen
47 FOSFATO DE CALCIO Características: - Pequeña expresión del transgén.Coprecipitación de DNA y calcio (presencia de fosfato). Introducción por endocitosis. Eficiencia de transfección 1% (max. 10%) Características: - Pequeña expresión del transgén. - Introducción de varias copias. - No hay toxicidad para las células. Modos de introducción del transgen
48 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - MicroinyecciónDIRECTOS - Bacterias/Virus - Liposomas INDIRECTOS IN VITRO Precipitación con fosfato de calcio QUÍMICOS Electroporación FÍSICOS FÍSICOS Modos de introducción del transgen
49 ELECTROPORACIÓN - Mucha muerte celular Características:Introducción del transgén por poros nucleares tras un choque eléctrico. Factores de eficacia: naturaleza, distancia entre electrodos, buffer y CÉLULAS. Características: - Mucha muerte celular - Tendencia a introducir una sola copia. Método de elección para la recombinación homóloga. Modos de introducción del transgen
50 ¿Cómo consigo un animal adulto a partir de células en cultivo?Modos de introducción del transgen
51 DOS OPCIONES 1 2 Células indiferenciadas que sean capaces de colonizarun embrión y formar parte de su organismo, incluidos los gametos. 1 DOS OPCIONES Células transformadas en indiferenciadas: CLONACIÓN 2 Modos de introducción del transgen
52 Células ES o indiferenciadasSÓLO AISLADAS EN RATÓN Modos de introducción del transgen
53 Las células ES no se han aislado en otras especies animalesNUMEROSOS INTENTOS PERO...... Las células ES no se han aislado en otras especies animales (Experiencias realizadas en peces) Modos de introducción del transgen
54 OTROS CULTIVOS CELULARES: Fibroblastos, Glándula mamaria, etc.Clonación de células somáticas Modos de introducción del transgen
55 DOLLY Modos de introducción del transgen
56 - Baja la transcripción. - Baja la traducción. DOLLY G0 : - Baja la transcripción. - Baja la traducción. - Condensación de la cromatina Modos de introducción del transgen
57 PRODUCCIÓN DE: Millie, Christa, Alexis, Carrel y Dotcom245 Polejaeva, I.A. y cols. (2000) Nature, 407, 86-90 5 72 Modos de introducción del transgen
58 Aplicaciones 2.-Producción de sustancias terapéuticas en1. Cambio de características de organismos utilizados en la producción de alimentos 2.-Producción de sustancias terapéuticas en - Organismos unicelulares. - Biotecnología de corral. 3.Nuevos alimentos - Cambio cuantitativo - Cambio cualitativo Aplicaciones
59 Aplicaciones 2.-Producción de sustancias terapéuticas en1. Cambio de características de organismos utilizados en la producción de alimentos 2.-Producción de sustancias terapéuticas en - Organismos unicelulares. - Biotecnología de corral. 3.Nuevos alimentos - Cambio cuantitativo - Cambio cualitativo Aplicaciones
60 Introducción del Gen LIS en levadura vinícalinalol linasa Sintesis de linalol Asociado a los componente de aroma afrutado y floral Aplicaciones
61 Aplicaciones 2.-Producción de sustancias terapéuticas en1. Cambio de características de organismos utilizados en la producción de alimentos 2.-Producción de sustancias terapéuticas en - Organismos unicelulares. - Biotecnología de corral. 3.Nuevos alimentos - Cambio cuantitativo - Cambio cualitativo Aplicaciones
62 Producción de proteínas recombinantes en organismos unicelularesAplicaciones
63 Crecimiento secundario Purificación proteínaTransformación Crecimiento secundario Purificación proteína Crecimiento a gran escala Salida al mercado
64 Biotecnología de corral- Transgénicos clásicos hasta ahora ya que no existían células indiferenciadas en los animales que nos interesan. - Producción de proteínas de interés en sanidad. Ejemplo (ya creado): Tracy (Roslin Institute - PPL Therapeutics) Aplicaciones
65 TRACY Promotor b-lactoglobulina as1-antitripsina humana ovinaAplicaciones
66 Primeros ensayos en ratón:4.3 Kb Promotor WAP de ratón 6.6 Kb de AAT-humano cDNA Obtienen microlitros de leche 12.5 gr./litro Volumen/año gr./año Producción vital 8 litros 400 litros l. 0.04 Kg. 2 kg. 50 kg 1 Kg. 100 kg. toneladas Coneja Oveja Vaca Aplicaciones
67 Anticuerpos humanizadosRoslin Institute-PPL Therapeutics (lo que sabemos......) as1-antitripsina Fibrinógeno Factor VII y Proteína C Factor XI BSSL (lipasa) Anticuerpos humanizados Aplicaciones
68 POLLY: Primer clon transgénicoAplicaciones
69 Aplicaciones 2.-Producción de sustancias terapéuticas en1. Cambio de características de organismos utilizados en la producción de alimentos 2.-Producción de sustancias terapéuticas en - Organismos unicelulares. - Biotecnología de corral. 3.Nuevos alimentos - Cambio cuantitativo - Cambio cualitativo Aplicaciones
70 Producción Animal/Nuevos alimentos Modificaciones cuantitativas- Muchos intentos realizados. - Transgénicos clásicos. - Animales y plantas usados en alimentación. Aplicaciones
71 Producción Animal/Nuevos alimentosREINO VEGETAL Aplicaciones
72 LA REVOLUCIÓN AZUL!!!! Ejemplo (ya creado):Un Salmón (Aqua Bounty Farms): - Promotor: AFP (proteína anticongelación) - cDNA: Hormona del crecimiento. Aplicaciones
73 Producción Animal/Nuevos alimentos Modificaciones cualitativas- Transgénicos clásicos. - Animales y plantas usados en alimentación. Reino vegetal: la mayoría de los alimentos. Reino animal: Proyectos de creación. Aplicaciones
74 Producción Animal/Nuevos alimentosReino vegetal Tolerancia a los herbicidas 54% Resistencia a insectos (Bt) 37% Resistencia vírica 14% Rasgos cualitativos >1% - Transgénicos clásicos. - Animales y plantas usados en alimentación. - Tomate Flavr-Savr. - Maíz Bt. Aplicaciones
75 Producción Animal/Nuevos alimentosReino vegetal Tomate Flavr-Savr: Primer producto transgénico comercializado en el mundo (Mayo de 1994). Maduración retardada. - Promotor: 35 S virus mosaico de coliflor. - RNA antisentido de la enzima poligalacturonasa (actuá sobre la pectina) Aplicaciones
76 Producción Animal/Nuevos alimentosReino vegetal Maíz Bt:Muchisima presion social. Maíz que expresa la toxina del Bacillus thuringiensis se une a los receptores del tubo digestivo del insecto (taladro). Aplicaciones
77 ¿Qué es un alimento transgénico?Productos vegetales: tomate "Flavr Svr”, Maiz Bt... - Productos de animales transgénicos:salmones, leche sin determinadas proteínas, etc. - Alimentos que en su preparación se utilizan sustancias modificadas genéticamente (cuajo recombinante) - Animales tratados con proteínas recombinantes... - Animales alimentados con alimentos transgénicos Aplicaciones