1 MÓDULO MÓDULO III ELECTRICIDAD Y ELECTROFORESIS II

2 carga de la partícula (pH) carga de la partícula (pH) fuerza iónica del mediofuerza iónica del medio tamaño (radio) y forma de la partículatamaño (radio) y forma de la partícula viscosidad del medio viscosidad del medio temperaturatemperatura Entonces, la movilidad electroforética depende de:  = v / E = q / k f Repasemos:

3 ¿Qué ocurre con la movilidad electroforética si... se modifica la caída de potencial aplicada? se modifica la caída de potencial aplicada? se modifica la longitud del soporte? se modifica la longitud del soporte?  = v / E se modifica el tiempo de corrida? se modifica el tiempo de corrida?  = d. L / t. Vab Discutamos los resultados obtenidos en el T.P.

4 de potencial? ¿Qué ocurrió con la movilidad electroforética a altos valores de diferencia de potencial? Discutamos los resultados obtenidos en el T.P. d V EFECTO JOULE Q/tpo = k.V.i

5 1 2 R tiempo de corrida Variación de la resistencia del soporte durante la corrida Papel Acetato de celulosa

6 Voltaje constante vs Intensidad constante Voltaje constante V = R.i = constante Q/t = k.V. i = k.R.i 2 Al transcurrir la corrida: R   i    Q/t  evaporación de solvente   Fuerza iónica    Refrigerar

7 Voltaje constante vs Intensidad constante Intensidad constante i = R/V = constante Q/t = k.V. i = k.R.i 2 Al transcurrir la corrida: R   V    Q/t pero como V  :  = d. L / t. V  d  debo  t   difusión   resolución

8 Equilibrio de disociación o ionización de un ácido débil en solución acuosa HA H + + A - [ H + ] [A - ] K A = [HA] Constante de disociación

9 Ecuación de Henderson Hasselbach [A - ] pH = pK A + log [HA] Tomando el log negativo de ambos miembros y sustituyendo - log [H + ] por pH y - log K a por pK A y ordenando: [ H + ] [A - ] K A = [HA]

10 Entonces... COO H 3 N – C – H R + - COOH H 3 N – C – H R + COO H 2 N – C – H R -

11 Variación de la movilidad electroforética con el pH del medio + - + - COO H 3 N – C – H R COO H 2 N – C – H R COOH H 3 N – C – H R pH pI

12 Movilidad electroforética en función del pH pI

13 Se dispone de un aminoácido que posee los siguientes grupos ionizables: COOH H 2 N – C – H R (NH 2 ) pKa = 2.0 pKa = 10.0 pKa = 12.0 a)Esquematice las estructuras predominantes a pH: 2, 5, 7, 8, 10, 12, 14. b)Calcule carga neta exacta a cada pH. c)Estime el pI aproximado a partir de los pKa.

14 Se desea determinar el pI de una proteína. Los datos experimentales obtenidos en las distintas corridas son: pHintensidad (mA) tiempo (minutos) distancia recorrida por la proteína (cm) distancia recorrida por el dextrano (cm) 2.04.020- 7.0 0.0 4.0 25- 4.0 0.0 6.07.040- 1.0- 0.5 8.03.025 2.0- 1.0 10.03.030 5.0- 2.0 Longitud de cada tira = 20.0 cm. Resistencia de cada tira = 10 5 . a) Determine el campo eléctrico aplicado en cada corrida. b) Calcule las movilidades de la proteína a cada pH. c) Calcule pI de la proteína.

15 Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: aminoácidos Neutros

16 Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: aminoácidos

17 Ácidos Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: aminoácidos

18 Básicos Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: aminoácidos

19 Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: polipéptidos y proteínas Son polímeros de aminoácidos unidos por uniones peptídicas Polipéptidos: 10 -100 aminoácidos Proteínas: más de 100 aminoácidos

20 Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: ácidos nucleicos (ADN y ARN)

21 Según su objetivo, la electroforesis puede ser: Preparativa: AISLAMIENTO de las distintas fracciones (utiliza mayor cantidad de muestra) Analítica: ANÁLISIS de las bandas obtenidas (utiliza poca muestra)

22 La electroforesis puede realizarse en forma: Vertical Horizontal Unidireccional Bidireccional

23 Tipos de electroforesis de uso más frecuente en la actualidad Electroforesis en medio soporte: - convencional - SDS-PAGE: densidad de carga uniforme  separación de proteínas por pesos moleculares - isoelectronfoque: gradiente de pH  alta resolución Electroforesis capilar

24 Al realizar una electroforesis debe tenerse en cuenta la selección de: 1) Objetivo de la electroforesis: tipo de electroforesis. 2) Soporte y buffer de corrida. 3) Modo y lugar de siembra de la muestra.

25 Al realizar una electroforesis debe tenerse en cuenta la selección de: 4) Condiciones de corrida: voltaje (bajo, mediano o alto) e intensidad. Si se trabaja con voltajes medianos y altos debe refrigerarse la corrida para evitar el efecto Joule. Puede trabajarse a voltaje o intensidad constante. 5) Tiempo de corrida

26 Al realizar una electroforesis debe tenerse en cuenta la selección de: 6) Revelado: colorantes inmunofijación enzimático transferencia a una membrana de nitrocelulosa y posterior revelado (inmunoblot) : Westernblot (proteínas), Southernblot (ADN), Northenblot (ARN)

27 ELECTROFORESIS LIBRE 1937 Tiselius CROMATOGRAFÍA Avance Tecnológico ELECTROFORESIS EN SOPORTES ELECTROFORESIS CAPILAR 2004 AUMENTO EN RESOLUCION Y SENSIBILIDAD

28 Electroforesis en a Electroforesis en acetato de celulosa Proteinograma de suero

29 SDS-PAGE

30 Isoelectroenfoque (IEF)

31 Electroforesis bidimensional

32 Electroforesis Capilar

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34 Páginas a consultar: 1)http://www.rit.edu/~pac8612/electro/Electro _Sim.htmlhttp://www.rit.edu/~pac8612/electro/Electro _Sim.html 2)http://micro.magnet.fsu.edu/electromag/java/ electrophoresis/http://micro.magnet.fsu.edu/electromag/java/ electrophoresis/ 3) http://www2.uah.es/biomodel/biomodel- misc/anim/elfo/electrof2.html http://www2.uah.es/biomodel/biomodel- misc/anim/elfo/electrof2.html

35 FIN