1 Monoklony in planta PLANTIBODIES

2 Cechy produkcji monoklonów w roślinachPrzewiduje się wprowadzenie nowych terapeutycznych mAb w ciągu 5 lat. Wymaga to potrojenia światowych zasobów bioreaktorów. Nie ma na to pieniędzy ani czasu. Do produkcji masowej w roślinach nie trzeba inwestować w bioreaktory (redukcja wkładu pieniędzy o 90%). Rośliny posiadają zadziwiająco podobny do zwierząt aparat biosyntezy białka Pozwalają uniknąć zakażeń odzwierzęcych (wirusy, priony, toksyny). Dodatkowo znikają koszty kontroli zakażeń i ich zwalczania

3 Najefektywniejsze bioreaktory- molecular farmingRośliny to najefektywniejsi na świecie producenci białka. Najniższe koszty utrzymania hodowli dostępna energia

4 Uzyskiwanie cDNA dla przeciwciałZ biblioteki fagowej (phage display) poprzez izolację DNA z fagów prezentujących na swojej powierzchni pożądane przeciwciało Bezpośrednio z kolonii hybrydom poprzez izolację ich RNA i odwrotną transkrypcję na cDNA. Następnie otrzymanym cDNA transformuje się roślinę wybraną metodą.

5 Porównanie 1-akrowe (63m * 63m) poletko kukurydzy daje tyle samo przeciwciał co 100,000 litrów komórek (ponad 6 ogromnych bioreaktorów) czyli ok. 18 kg przeciwciał na rok. Plantibodies mogą kosztować na rynku $0,1 - 1$ za gram, te z kultur komórkowych kosztują teraz $200 - $650 za gram

6 Koszty produkcji białek w różnych systemachStosunek cenowy 1:3000

7 Ale nie można w nich produkować mAbPorównanie czasowe Ale nie można w nich produkować mAb lata

8 Promotory dla genów przeciwciałPromotory tkankowo-specyficzne pozwalają wybrać pożądane miejsce ekspresji (liście, korzenie, nasiona...). Ułatwia to oczyszczanie przeciwciał z rośliny i uzyskanie odpowiedniej ich akumulacji Zwraca się także uwagę na bezpieczeństwo ekologiczne. Np. pomidorowy promotor (HMGR2) z genu aktywowanego szokiem mechanicznym (MeGA). Ekspresja transgenu jest aktywowana dopiero w momencie zbierania i przetwarzania rośliny co prowadzi do błyskawicznej translacji białka (24h)

9 Oczyszczanie mAb z roślinAkumulacja w ciałkach tłuszczowych nasion Transgeniczna oleozyna wchodząca w skład ich powierzchi zawiera w sobie białko A wiążące Ab Faza tłuszczowa Faza wodna

10 Nie trzeba niszczyć roślin w celu zebrania przeciwciałOczyszczanie – c.d. Nie trzeba niszczyć roślin w celu zebrania przeciwciał Skierowanie białka do ryzosekrecji umożliwia jego odzysk wprost z podłoża hydroponicznego. Skierowanie do wydzieliny gutacyjnej- odzysk wprost z powierzchni liścia

11 Ekspresja w nasionach kukurydzyBiałko w nasionach można długo składować (3 lata w lodówce) i jest zawarte w małej objętości co ułatwia oczyszczanie

12 Otrzymano już wszystko wszystkofragment SC ramię J

13 secretory-IgA (wydzielnicze)Wykorzystuje się je (w dużej ilości – kilka gramów na dzień) gdy przeciwciała muszą być stosowane miejscowo lub wziewnie na błony śluzowe. (Zapobieganie infekcjom patogenów wenerycznych, astma) Są odporne na proteolityczne środowisko nabłonków Są bardziej zachłanne (dimery)  koagulacja bakterii (zatem dodatkowa ochrona niespecyficzna) U ssaków SC jest „dokładany” do IgA w komórkach nabłonka podczas sekrecji do światła narządu (jelito, przewody oddechowe). Rośliny transfekowane genami dla IgA i S.C. (=komponentu wydzielniczego) potrafią złożyć sIgA od razu, w jednej komórce.

14 Powstają różne konstrukty białkowe jednak ilość sIgA jest zadowalająca

15 Próchnica zębów, o której było głośno Przykład produkcji sIgA w roślinachImmunizując myszy otrzymano przeciwciała IgG przeciwko białkom powierzchniowym ludzkiego Streptococcus mutans (powodują próchnicę) Konstrukty hybrydowych przeciwciał sIgA/G (z sIgA - wiązanie przez SC, zdolność dimeryzacji, z IgG – część zmienna) wklonowano do tytoniu. Ekspresja białka w liściach. Aplikowano ludziom doustnie wyizolowane przeciwciała. Są tak samo powinowate jak oryginały IgG z myszy, lecz bardziej zachłanne! (tworzą dimery) Bardziej odporne na proteolizę przez bakterie Brak rekolonizacji przez bakterie w przeciągu 3 miesięcy (tyle trwał eksperyment)

16 Weterynaria - Drób Jako pasywna i aktywna szczepionka przeciwbakteryjna w paszy-duża ilość Ab, nie trzeba oczyszczać Pozwalają uniknąć stosowania antybiotyków które potem zjadamy Ziarna kukurydzy zawierają kurze sIgA, które w przewodzie pokarmowym zwiększają wyłapywanie patogenu i jego prezentację komórkom ukł. immunologicznego Wytwarza się systemowa odporność swoista

17 Widmo glikozylacji Przeciwciała to glikoproteiny. IgG mają ok. 30 N-glikozylacji. Np. na każdej z 2 domen CH2 regionu stałego (Fc) niezbędna jest ona do wywołania toksyczności przeciwciało-zależnej ADCC (terapia raka)

18 Glikoinżynieria Oczywiście glikozylacja jest inna niż u zwierząt. Rośliny np. wykorzystują wiązania  (1–3)-fukoza oraz (1–2)- ksyloza, niespotykane u ssaków. Brak natomiast kwasu sjalowego (całego szlaku syntezy) U hybrydom i myszy jest też inna niż u ludzi. Ludzkie Ab mają tylko N-acetyloneuraminowy (NANA), gryzonie mieszaninę NANA + N-glikozylo-neuraminowego. Nie zaobserwowano wpływu toksycznego czy immunogennego ani zmniejszonego powinowactwa z tego powodu. Jednak jest to potencjalny problem, zwłaszcza gdy dla swoistości Ig wymagana jest glikozylacja lub ważny jest fragment Fc aktywujący makrofagi i układ dopełniacza.

19 Glikoinżynieria DODAĆ USUNĄĆ

20 Glikoinżynieria Każda reakcja przyłączenia cząsteczki cukru jest prowadzona przez specyficzną transferazę( N-oligo-saccharyltransferase, galactosyltransferase, sialyltransferase), rozpoznającą (w ER lub GA) strukturę przestrzenną fragmentu białka które modyfikują.

21 Glikoinżynieria-rozwiązaniaPoznano zestaw genów jakie należy dodać, wyciszyć lub wzmocnić aby uzyskać glikozylację całkowicie ludzką. Można uzyskać ich ekspresję w roślinie lub transgenicznych gryzoniach Możliwa także modyfikacja enzymami in vitro po oczyszczeniu białka, ale jest to kosztowne

22 Glikoinżynieria Wprowadzenie transgenu ssaczej transferazy

23 Retencja w ER (KDEL), nie ma dalszej glikozylacji w GAGlikozylacja DODAĆ cukry USUNĄĆ cukry In vitro Transgeny dla glikotransferaz Retencja w ER (KDEL), nie ma dalszej glikozylacji w GA Knock-out genu transferazy

24 Zastosowania plantibodiesCele medyczne i weterynaryjne (rak, HIV, HCV, próchnica, leczenie przedawkowań...) Pasywna immunizacja roślin przeciwko grzybom, wirusom, insektom (produkcja np. na liściach) Wydzielanie przez rośliny do ziemi abzymów rozkładających np. mocznik hamujący fotosyntezę Immunomodulacja roślin i zwierząt-poznawanie funkcji blokowanych przeciwciałem białek Antitransformation-kierowanie genów np. śmierci do konkretnej komórki

25 koniec 1. Anonymous (2002) Wkly. Epidemiol. Rec. 77, 109–120.2. Wilde, H., Tipkong, P. & Khawplod, P. (1999) J. Travel Med. 6, 238–242. 3. Daniell, H., Streatfield, S. J. & Wycoff, K. (2001) Trends Plant Sci. 6, 219–226. 4. Hiatt, A., Caffertey, R. & Bowdish, K. (1989) Nature 342, 76–78. 5. Ma, J. K., Hikmat, B. Y., Wycoff, K., Vine, N. D., Chargelegue, D., Yu, L., Hein, M. B. & Lehner, T. (1998) Nat. Med. 4, 601–606. 6. Zeitlin, L., Olmsted, S. S., Moench, T. R., Co, M. S., Martinell, B. J., Paradkar, V. M., Russell, D. R., Queen, C., Cone, R. A. & Whaley, K. J. (1998) Nat. Biotechnol. 16, 1361–1364. 7. Khoudi, H., Laberge, S., Ferullo, J. M., Bazin, R., Darveau, A., Castonguay, Y., Allard, G., Lemieux, R. & Vezina, L. P. (1999) Biotechnol. Bioeng. 64, 135–143. 8. Bouquin, T., Thomsen, M., Nielsen, L. K., Green, T. H., Mundy, J. & Dziegie, M. H. (2002) Transgenic Res. 11, 115–122. 9. Conrad, U. & Fiedler, U. (1998) Plant Mol. Biol. 38, 101–109. 10. Mann, M. & Jensen, O. N. (2003) Nat. Biotechnol. 21, 255–261. 11. Faye, L., Gomord, V., Fitchette-Laine, A. C. & Chrispeels, M. J. (1993) Anal. Biochem. 209, 104–108. 12. van Ree, R., Cabanes-Macheteau, M., Akkerdaas, J., Milazzo, J. P., Loutelier- Bourhis, C., Rayon, C., Villalba, M., Koppelman, S., Aalberse, R., Rodriguez, R., et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 11451–11458. 13. Helenius, A. & Aebi, M. (2001) Science 291, 2364–2369. 14. Navazio, L., Miuzzo, M., Royle, L., Baldan, B., Varotto, S., Merry, A. H., Harvey, D. J., Dwek, R. A., Rudd, P. M. & Mariani, P. (2002) Biochemistry 41, 14141–14149. 15. Henderson, J., Bauly, J. M., Ashford, D. A., Oliver, S. C., Hawes, C. R., Lazarus, C. M., Venis, M. A. & Napier, R. M. (1997) Planta 202, 313–323. 16. Bauly, J. M., Sealy, I. M., Macdonald, H., Brearley, J., Droge, S., Hillmer, S., Robinson, D. G., Venis, M. A., Blatt, M. R., Lazarus, C. M. & Napier, R. M. (2000) Plant Physiol. 124, 1229–1238. 17. Sharp, J. M. & Doran, P. M. (2001) Biotechnol. Bioeng. 73, 338–346. 18. Rudd, P. M., Elliott, T., Cresswell, P., Wilson, I. A. & Dwek, R. A. (2001) Science 291, 2370–2376. 19. Dietzschold, B., Gore, M., Casali, P., Ueki, Y., Rupprecht, C. E., Notkins, A. L. & Koprowski, H. (1990) J. Virol. 64, 3087–3090. 20. Prosniak, M., Faber, M., Hanlon, C. A., Rupprecht, C. E., Hooper, D. C. & Dietzschold, B. (2003) J. Infect. Dis. 187, 30386–30389. 21. Datla, R. S. S., Bekkaoui, F., Hammerlindl, J. K., Pilate, G., Dunstan, D. I. & Crosby, W. L. (1993) Plant Sci. 94, 139–149. 22. Kay, R., Chan, A., Daly, M. & MacPherson, J. (1987) Science 236, 1299–1302. 23. Ko, K., Norelli, J. L., Reynoird, J.-P., Boresjza-Wysocka, E., Brown, S. K. & Aldwinckle, H. S. (2000) Biotechnol. Lett. 22, 373–381. koniec