1 MUERTE CELULAR APOPTÓTICA IN VITRO DURANTE LA DIFERENCIACIÓN ERITROIDEZamai et al. Apoptosis 9: , 2004

2 ERITROPOYESIS Stem cells  células eritroides tempranas y tardías  eritrocitos Diferenciación eritroide: -  sensibilidad a EPO -  Glicoforina A -  CD45 - cambios nucleares - pérdida organelas - síntesis Hb

3 ANTECEDENTES Médula ósea normal  eritroblastos apoptóticos Eritroblastos inmaduros  receptores de muerte (Fas, TRAIL-R1 y TRAIL-R2) Eritroblastos maduros, macrófagos y células NK inmaduras  ligandos FasL y TRAIL Homeostasis  balance EPO vs. TRAIL y FasL

4 OBJETIVO Caracterizar la muerte de células eritroides que ocurre in vitro MÉTODOS Sangre  células mononucleares  CD34+  cultivo en medio sin suero (+ SCF + EPO + IL-3) Diferenciación unilinaje  población homogénea de células

5 CITOMETRIA DE FLUJO Ag de membrana (CD34, CD45, Glicoforina A) - Ag intracelulares (HbA y HbF) Características apoptóticas / Ciclo celular: Anexina-V Coloración supravital con IP FSC – SSC EtOH permeabilización + IP

6 Microscopía electrónica de transmisión (TEM)  características ultraestructuralesElectroforesis de ADN (ladder)  fragmentación del ADN Microscopía de fluorescencia  TUNEL marcación de 0H 3’ (dUTP-FITC)

7 CITOMETRIA DE FLUJO: (seguimiento de la diferenciación)Gli+ (low-int)  % Gli+ (intenso)  FSC  SSC  % Gli+ (intenso)  FSC  SSC (tamaño) (complejidad)

8 Citometría de flujo: detección de HbF y HbATinción con bencidina 20-25% Citometría de flujo: detección de HbF y HbA 80%

9 Microscopía electrónica de transmisión de células eritroides

10 Citometría de flujo: expresión de CD45Tinción con May-Grünwald-Giensa R1 = eritroide R2 = mieloide temprana + blastos R3 = mieloide tardía + neutrófilos R4 = monocitos R5 = células muertas

11 CITOMETRIA DE FLUJO: Glicoforina A vs. Anexina-V-FITCGli débil/Anx-V+ Gli neg / Anx-V+  Gli débil/Anx-V+  Gli débil/Anx-V+

12

13 Microscopía electrónica de transmisión de células apoptóticas

14 Citometría de flujo: ciclo celularLadder de ADN

15 Microscopía de fluorescencia: Reacción TUNEL

16 DISCUSIÓN Diferenciación asociada con apoptosisCélulas eritroides tienen particular tendencia a apoptosis (característica intrínseca?) Progenitores eritroides con distinta sensitividad a EPO

17 DIFERENCIACIÓN ERITROIDE Glicoforina A Hemoglobina adulta Tamaño Complejidad Material granular  Hemoglobina APOPTOSIS Anx-V+ Alteraciones nucleares Pico subdiploide Fragmentación ADN Hipótesis: apoptosis se induce en el estadio del eritroblasto basófilo

18 CONCLUSIÓN El incremento paralelo de células apoptóticas y células eritroides maduras, sugiere que la interacción entre eritroblastos inmaduros y maduros (donde los últimos pueden ejercer una actividad citotóxica sobre los primeros) contribuye a inducir apoptosis durante la diferenciación eritroide in vitro. Este proceso podría representar una reproducción del feedback regulatorio negativo observado en las islas eritroblásticas de la médula ósea.