1 NORMAL ve BOZULMUŞ YARA İYİLEŞMESİNDE OKSİDATİF STRES Pharmacological Research 2008, issue:58, pg:165-171 Mattias Schafer, Sabine Werner ETC Zürich,Institute of Cell Biology Sunan : Opr. Dr. Rasim Levent Kılıçaslan ANKARA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ FİZYOPATOLOJİ BİLİM DALI

2 YARA İYİLEŞMESİ SÜRECİ Vücudun en dış kısmını oluşturan deri çevresel etkenlere karşı doğal bir engel oluştururken bir dizi gerekli korucu işlevleri de taşır. Akut yaralanmalar yada kronik etkilerle cilt bütünlüğünün bozulması sonucunda en azından yaralanma dokusunun kısmen yeniden yapılanmasını ve derinin koruyucu engel işlevini yeniden oluşturan çok basamaklı bir işlem başlatılır. Bu yara iyileşmesi süreci histolojik düzeyde birbirinden ayrı ancak birbiri üzerine de binen üç evreden oluşur: 1.)HEMOSTAZ ve ENFLAMASYON, 2.)YENİ DOKU OLUŞUMU (Proliferasyon ve Anjiogenez) ve 3.)OLUŞAN DOKUNUN YENİDEN YAPILANDIRILMASI(Remodeling ve Maturasyon). Yaralanmanın hemen ardından oluşan damar hasarı trombosit tıkaç oluşumunu ve kan pıhtılaşmasını başlatır. Bunun sonucu olarak yarada geçici bir mühür oluşur. Bu işlem aynı zamanda bir dizi farklı bağışıklık hücresinin yarayı işgal etmesine yol açan “ENFLAMATUVAR EVRE”yi de başlatır.

3 Yara dokusuna önce dolaşımda bol bulunmaları nedeniyle nötrofiller gelir onları daha sonra dokuya geçince makrofaj adını alan monositler izler. Bu doğal immun sistem hücreleri proteolitik enzimleri ve pro enflamatuvar sitokinleri salgılarlar. Aynı zamanda bu hücreler organizmayı bakterilerin ve diğer mikroorganizmaların saldırısından koruyan fazla miktarda ROS (Reaktif Oksijen Türleri) sentezler ve salgılarlar. Bakteriler ve hücresel yıkım artıkları daha sonra yara bölgesinden fagositozla uzaklaştırılırlar. 3

4 PROLIFERASYON EVRESİ : İmmun hücrelerin ve pro enflamatuvar sitokinlerin seviyesi azalırken; keratinositler, fibroblastlar ve endotel hücreleri yara bölgesine doğru göç etmeye ve yara iyileşmesinin ikinci evresi olan yeni doku oluşumu evresi için prolifere olmaya başlarlar. Yaralanma ardı 1-2 gün sonra hasarlanmış dermis boyunca keratinositlerin göçü ile “RE EPİTELİZASYON” başlar.

5 Eş zamanlı olarak hasarlı dermisin onarılması da oluşur. Oluşan bu yeni doku başlangıçta yitirilen dermis ile yer değiştirir, içerediği sayısız kapillerlerin granuler görüntüsü nedeniyle “Granülasyon dokusu” olarak adlandırılır. Granulasyon dokusu : fibroblaslar,endotel hücreleri ve enflamatuvar hücrelerinden oluşur. Yaraya kenarından tutunan fibroblastlar prolifere olup yeni hücre dışı matriksini oluşturur. Bunun yanısıra kemik iliği mezanşimal hücreleri de yaraya tutunarak granulasyon dokusundaki fibroblast topluluğuna katılırlar. Fibroblastlar yara kenarındaki keratinositlerin migrasyonunu ve proliferasyonunu daha da uyarırlar.Bunun sonucu yaranın tamamiyle “Neoepidermis” ile kaplanmasıdır.

6 Granulasyon dokusundaki fibroblastlar yara kasılmasından(yara kontraksiyonu işlevinden ) sorumlu olan ve kollajen ile diğer hücre dışı matriks proteinlerinin üretiminden sorumlu olan “myofibroblast”lara dönüşürler. Yeni dokuyu oksijen ve besinle desteklemek için yara kenarlarında kan damarı tomurcuklanmaları oluşur ve granülasyon dokusu sürekli olarak yeni kan damarları ile döşenir (Anjiogenez). Buna ek olarak lenfatik vasküler yapıları da onaracak lenfanjiogenez de gelişir. Yara iyileşmesi süreci uzun bir “RE MODELING”=”Yeniden şekillenme” ve ”MATURASYON” = ”Olgunlaşma” işlemi ile sona erer.

7 RE MODELİNG’de yara iyileşmesinin başlangıcındaki kalınlığı artırılmış epidermis keratinositlerin yeniden farklılaşması ile normal kalınlığına döner. Bu ise cilt duvarı engelinin onarımı sonucunu doğurur. Endotel hücreleri, miyofibroblastlar ve enflamatuvar hücrelerin oluşturduğu yoğun hücresellik içeren granulasyon dokusundaki hücreler hücre sayısını azaltacak bir sonuç doğuracak şekilde apopitoza giderler. Ek olarak hücre dışı matriksin yeniden yapılanması oluşarak granulasyon dokusundaki tipik Kollajen tip III daimi olarak Kollajen tip I’le yer değiştirir. MATURASYON (olgunlaşma) daha sonra artmış moleküller arası çapraz bağlar ile oluşur. Bu yara açılmasına karşı doku direncini (yara kırılma direnci) artırsa da normal cildin asıl direnci asla tam olarak onarılamaz.

8 Cilt yaralanması ardından erişkin memelilerin cildinde tam rejenerasyon her ne kadar oluşmasa da, sağlıklı bireylerde yara iyileşmesi eğer yara çok geniş değil ise fonksiyonel ve estetik bozukluklarla sonuçlanmaz; genellikle sorunsuzdur. Buna karşın hatırı sayılır miktardaki hasta yara iyileşme anormalilerinden muzdariptir. Yara iyileşmesi; özellikle yaşlı bireylerde, diabeti olan hastalarda, kanser için kemoterapi yada radyoterapi alan hastalarda bozulur. Bunun sonucu olarak kronik ve iyileşmeyen genellikle ağrılı tedavisi zor ülserler gelişir. En kötü durumda ise inatçı ısrarcı enflamasyon sonucu olarak kronik yara dokusunda kanser gelişebilir. Öte yandan yara iyileşmesi aşırıya da kaçabilir ve hipertrofik skarlar ve keloidlerin oluşumu ile de sonuçlanabilir.

9 ROS (REAKTİF OKSİJEN TÜRLERİ)’NİN YARA İYİLEŞMESİNDEKİ ROLÜ Yara iyileşmesi işlemi bir çok farklı büyüme faktörleri,sitokinler ve hormonlar tarafından düzenlenir.Bunlara ek olarak Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS) ve Nitrik Oksitin (NO)’de yara iyileşme sürecinde gerekli olduğu da bir dizi çalışma ile açıklanmıştır.

10 ROS (Reaktif Oksijen Türleri) saldırgan patojenlere karşı savunma için gereklidirler. Düşük düzeylerdeki ROS (Reaktif Oksijen Türleri ) ise hücrelerarası sinyal iletiminde gereklidir. Örneğin düşük düzeylerdeki Hidrojen Peroksit’in etkili bir yara anjiogenezi için gerekli olduğu saptanmıştır. Buna karşılık aşırı artmış ROS düzeyleri aşırı reaktif olmaları sebebi ile yara iyileşmesini geciktirir. Oksidatif Stres Bu derlemede özellikle kronik ve iyileşmeyen yaralarda olmak üzere; cilt yaralarında “Oksidatif Stres” varlığında gelişen olaylar özetlenmiştir. Bunu ardından düşük moleküllü anti oksidantların yara dokusundaki varlığı ile tamir sürecindeki fonksiyonları anlatılacak; son olarak da yara iyileşme sürecinde ROS detoksifiye eden enzimlerin ekspresyonu ve fonksiyonları özetlenecektir.

11 FARKLI TİPLERDEKİ ROS (REAKTİF OKSİJEN TÜRLERİ)’NİN OLUŞUMU VE DETOKSİFİKASYONU ROS (Reaktif Oksijen Türleri) solunum zincirinde olduğu gibi normal metabolik işlevler sırasında tüm hücreler tarafından üretilir. “solunum patlaması” (respiratory burst) Özellikle yaralanmış yada iltehaplı dokularda yüksek oranlarda NADPH Oksidaz tarafından üretilirler. NADPH Oksidaz enflamatuvar hücreler tarafından yüksek düzeyde eksprese edilen bir enzim kompleksidir. Bu olgu “solunum patlaması” (respiratory burst) olarak tanımlanır. NADPH Oksidaz’ın aktivasyonuna bağlı olarak hücreler yüksek etkileşimli Superoksit Radikali iyonu (OH) üretirler. Daha sonra bu birçok Superoksit Dismutaz enzimi ile hızla Hidrojen Peroksit (H₂O₂) ve suya (H₂O) yıkılır. Fenton Reaksiyonu Hidrojen Peroksit (H₂O₂) bir radikal olmasa da bakır (Cu) ve demir (Fe) iyonları varlığında Fenton Reaksiyonu ile Hidroksil Radikalleri (OH) üreterek ciddi hücresel hasara neden olabilirler. Hidroksil Radikalleri (OH) yüksek oranda agresif olup hücresel makro moleküllerde oksidasyona neden olurlar. Bu nedenle Hidrojen Peroksit(H₂O₂) hızla Katalaz, farklı Peroksidazlar, Peroksiredoksinler tarafından detoksifiye edilmelidir. Bunlardan sonuncusu Peroksiredoksinler aynı zamanda Lipid Peroksitleri de detoksifiye etmektedir.

12 ROS (Reaktif Oksijen Türleri)’ne karşı direnç ; ROS Detoksifiye edici enzimlerin yanı sıra farklı endojen ve eksojen düşük molekül ağırlıklı antioksidanların aracılığı ile de başarılmaktadır. Eğer ROS (Reaktif Oksijen Türleri) detoksifikasyonu yetersiz ise yada çok fazla miktarda ROS üretilmişse; ciddi hücresel hasarlara, erken yaşlanmaya hatta kanser gelişimine yol açan Oksidatif Stres oluşur.

13 CİLT YARALARINDA OKSİDATİF STRES İÇİN KANITLAR ROS (Reaktif Oksijen Türleri)’nin kısa yarı ömürleri nedeniyle invivo koşullarda derişimlerini belirlemek güçtür. Buna rağmen Hidrojen Peroksit (H₂O₂) düzeyleri gerçek zamanlı H₂O₂ elektro kimyasal ölçümü kullanılarak murin (fare benzeri kemirgen memeli) akut eksizyonel yara sıvılarında yakın zamanda saptanabilmiştir.(Roy S, Khanna S, Nallu K et all, Dermal wound healing is subject to redox control. Molecular Theraphy 2006,13,211-220). Bu çalışmada 100-250 Μm Hidrojen Peroksit (H₂O₂)’in yara bölgesinde varlığı açığa çıkarılmıştır. Yaralanma ardı 5 gün sonrasında yeni doku oluşumunun bulunduğu geç safha ile karşılaştırıldığında daha yüksek Hidrojen Peroksit düzeyleri (H₂O₂)’nin yaralanma ardı 2. günde erken enflamatuvar evrede görüldüğü bulunmuştur. Hidrojen Peroksit (H₂O₂)’e ek olarak yara kenarında Superoksitin varlığı da aynı araştırmacılar tarafından redoksa hasas boya olan Dihidroetidyum ile frozen kesitlerinin boyanması ile saptanmıştır. Aynı araştırmacı grubu daha önceki bulgularını da yakın zamanda yüzeyel uygulanan Nitroksit N₁₅-Perdeuterated tampon non invaziv ölçümünü kullanan spektroskopi temelli yaklaşım içeren elektron paramagnetik resonans ile yaptıkları çalışmada da doğrulamışlardır.

14 Bu çalışmalar fare tam kat eksizyonel kesi yaralarında yaralanma ardı 2. gün civarında Superoksit seviyelerinin zirve yaptığını göstermektedir. Aynı çalışmada Superoksit üretimi ; NADPH Oksidaz enzimi gerekli alt ünitelerinden biri de olan Rac2 eksikliği olan farede bozulmuştur ve bu eksiklik farede bozulmuş yara iyileşmesi ile de bağıntı göstermektedir. (Ojha N,Roy S,Khanna S et all, Assesment of wound site redox envirolment and significance of Rac2 in cutaneous healing. Free Radical Biochemistry,2008,189,41-54.) Bu sonuçlar normal yaralardaki düşük düzeydeki ROS seviyesinin yara tamiri işlemi için önemli olduğunu göstermektedir. İleride bu teknolojilerin kullanılarak kronik ve iyileşmeyen yaralarda ROS seviyelerinin analizi ilginç olabilir. Çoğu çalışmada yara bölgesindeki ROS (Reaktif Oksijen Türleri) düzeyleri ; lipid, protein yada DNA’nın oksidasyon ürünlerinin analizi yoluyla dolaylı olarak saptanmaktadır. Lipid Peroksidasyonu’nun ana ürünü murinlerin (fare benzeri kemirgen memeli) eksizyonel yara kenarlarından immun histokimya ile saptanabilen 4-hidroksi-2- nonenal (4-HNE) dir. İlgilinç bir şekilde 4-HNE çoğunlukla nötrofillerle aynı konumda bulunur ki bu da nötrofillerin respiratuvar patlamasının (respiratory burst) Superoksit ürettiğini bunun da duruma göre Lipid Peroksidasyonuna neden olduğunu gösterir. (Ojha N,Roy S,Khanna S et all, Assesment of wound site redox envirolment and significance of Rac2 in cutaneous healing. Free Radical Biochemistry,2008,189,41-54.)

15 Bir diğer Lipid Peroksidasyonu ürünü; özellikle yüksek düzeyde hidrokortizonla tedavi edilen ve yara iyileşmesi kontrol gruplarla karşılaştırıldığında bozulmuş sıçanlarda bulunan Malondialdehid (MDA) dır. (Gupta A,Sing RI,Raghubir R et all.Anti oxidant status during cutaneous wound healing in immuno comprimised rats.Molecular Cell Biochemistry,2002,241,1-7). İlginç olanı insanlarda kronik yaralarla akut yaralar arasında yara dokusundan alınan sıvılarda MDA yönünden bir farklılık bulunmamasıdır. (Moseley R,Hilton JR, Waddington RJ et all. Comparison of oxydative stress biomarker profiles between acute and chronic wound envirolments.Wound Repair Regeneration,2004,12,419-429). Öncelikle Araşidonik asit olmak üzere esansiyel yağ asitlerinin peroksidasyonu prostaglandin benzeri moleküller olan İsoprostanların oluşumu ile neticelenir. İnsanlardaki akut yaralardan alınan sıvılarla karşılaştırıldığında kronik venöz ülserlerden alınan sıvılarda 8-Isoprostanon derişiminde güçlü bir artış bulunmuştur.(Yeoh-Ellerton S,Stacey MC.Iron and 8-Isoprostanone levels in chronic and acute wounds. Journal of Investigative Dermatology,2003,121,918-925). Bu bulgular kronik ülserde oksidatif stres varlığının ve bunun güçlü iltehabi infiltrasyonun devamlılığı sonucu oluştuğunun kanıtıdır. Akut cerrahi kesi yaralarından alınan sıvı ile karşılaştırıldığında; kronik bacak ülserlerindeki yaralardan alınan sıvıda belirgin artışı saptanan Allantoin/Ürik Asit oranı da bu hipotezi doğrulamaktadır. Allantoin/Ürik Asit oranı Oksidatif Stres için bir belirteç timsalidir.(James TJ, Hughes MNA, Cherry GW,TaylorRP. Evidence of oxydative stress in chronic venose ulcers. Wound Repair and Regenesis.2003,11,172-176).

16 Oksidatif Stresi okumanın bir alternatif yolu da in vivo koşullarda okside olmuş proteinleri saptamaktır. Oksiblot Analizleri kullanılarak karbonil grupları ile özellik kazanan okside olmuş proteinler tespit edilebilir. Sağlam fare derisine göre yaralanmış fare derisinde okside olmuş protein düzeylerinde güçlü bir artış görülmektedir.

17 İlginç olanı erkek denek farelerdeki yaralar daha yüksek düzeyde okside olmuş protein içermekteydi. Bu ise dişi farelerle kıyaslandığında; erkek farelerdeki artmış enflamasyon ve azalmış yara iyileşme oranları ile bağıntı göstermektedir. (Ascroft GS, Mills Sj. Androgen receptor mediated inhibition of cutaneous wound healing. Journal of Clinical Investigation.2002,110,615-624). Buna rağmen şaşırtıcı bir şekilde insandaki kronik yaralardan alınan sıvılardaki protein karbonil içeriğinin akut yaralara göre daha az olduğu gösterilmiştir. (Moseley R,Hilton JR, Waddington RJ et all. Comparison of oxydative stress biomarker profiles between acute and chronic wound envirolments.Wound Repair Regeneration,2004,12,419-429). Bu olgunun doku lizatları ile saptanarak doğrulanması ilginç olabilir. Protein oksidasyonunu saptamanın diğer bir olasılığı da Nitrotirosin’in immuno histokimyasal tespitidir. Nitrik Oksit (NO) ile kombinasyon halinde ROS (Reaktif Oksijen Türleri) Peroksinitritlerin oluşumuna katılırlar. Peroksinitrit agresif bir molekül olup; proteinlerin Tirosin artıkları ile tepkimeye girerek Tirosin’in Nitrasyonu’nu oluşturur.

18 Nitrotirosin’e karşı antikor ile immun boyama yaban tipi farede granulasyon dokusunda Nitrotirosinli proteinlerin varlığını göstermiştir. ROS detoksifiye edici enzim Peroksiredoksin 6 (Prdx 6) kusuru olan farede Nitrotirosin Pozitif hücre sayısında güçlü artış gösterilmiştir. (Kumin A, Schafer M, Epp N et all. Peroxiredoksin 6 is required for blood vessel integrity in wounded skin.Journal of Cell Biology.2007,179,747-760).

19 YARA İYİLEŞMESİNDE DÜŞÜK MOLEKÜLLÜ ANTİOKSİDANLARIN ROLÜ Birçok düşük moleküler ağırlıklı antioksidanın cilt yaralarının iyileşmesindeki redoks çevresini düzenlediği iddia edilmiştir. Bunlar : Glutatyon, Ubikinonlar, Ürik asit, Lipioik asit ve besinlerde bulunan birleşiklerden Vitamin E, Vitamin C (Askorbik asit), Karotinoidler gibi “Endojen Moleküller “ yada “Fenolik Bileşikler” olabilir. Bu antioksidanların cilt yaralarının iyileşmesi işlemindeki fonksiyonel önemi bu antioksidanların yoksunlukları ile önerilmiştir. Örneğin kemirgenlerde normal cilt ile karşılaştırıldığında akut yaralarda Vitamin E, Askorbat ve Glutatyon düzeyleri % 60-70 oranında düşmüş; sadece Glutatyon seviyesi yaralanma ardı 14 gün içinde tamamiyle düzelebilmiştir. (Shukla A, Rasik AM, Patnaik GK. Depletion of reduced Glutathione, Ascorbic Acid, Vitamin E and antioxidant defence enzymes in healing cutaneous wound. Free Radical Research.1997,26,93-101). İlginçdirki ; genç sıçanlarla karşılaştırıldığında yaşlı sıçanlardaki yaralarda Vitamin E ve Glutatyon seviyeleri daha düşüktü. (Rasik AM,Shukla A. Antioxidant status in delayed healing type wounds. International Journal of Experimental Pathology.2000,81,257-263). Bu da yaşlı hayvanlarda görülen iyileşme gecikmesi ile bağıntı göstermektedir.

20 Başka bir çalışmada bağışıklık duyarlılığı tam hayvanlarla karşılaştırıldığında normal ve yaralı bölgesinin kısmi bağışıklığı baskılanmış hayvanların Glutatyon, Vitamin E ve Askorbat düzeylerinde güçlü bir azalma gözlenmiştir. (Gupta A, Sing RI, Raghubir R et all. Anti oxidant status during cutaneous wound healing in immuno comprimised rats. Molecular Cell Biochemistry,2002,241,1-7). Ayrıca diabeti olmayan farelerle ile karşılaştırıldığında; yaralarında iyileşme bozukluğu bulunan diabetli farelerde azalmış Glutatyon seviyeleri gözlenmiştir. (Mudge BP, Harris C, Gilmont RR et all. Role of Glutathion redox dysfunction in diabetic wounds. Wound Repair Regeneration.2002,10,52-58). Bu sonuçlar bozulmuş yara iyileşmesinin ; düşük moleküler ağırlıklı antioksidanların azalmış seviyeleri ile beraberlik gösterdiğine işaret etmekte ve düşük moleküler ağırlıktaki antioksidanların azalmış düzeylerinin artırılması ile yara tamiri işleminin düzeleceğini düşündürmektedir. (Rasik AM, Shukla A. Antioxidant status in delayed healing type wounds. International Journal of Experimental Pathology.2000,81, 257-263). Aslında bu hipotez bir çok çalışmada farklı yara iyileşme modelleri kullanılarak desteklenmiştir. Örneğin Vitamin E yada α-Tokoferol destek tedavisi diabetik farelerin yara dokularında Lipid Peroksitleri seviyelerini azaltmış ve özellikle Vitamin E ile tedavi edilen hayvanlarda yara iyileşme işlemi güçlendirilmiştir. (Musalmah M, Nizrana MY, Fairuz AH et all. Comperative effects of palm Vitamin E and α-Tocopherol on healing and wound tissue antioxidant enzyme levels in diabetic rats. Lipids.2005,40,575-580).

21 Hidrofilik bir Vitamin E benzeri antioksidan Raxofelast sistemik tedavisi ile genetik olarak diabetik farelerde yara iyileşmesi ve anjiogenez düzelirken yaban tipi farelerde hiçbir etki gözlenmemiştir. (Altavilla D, Saitta A, Cucinotta D et all. Inhibition of lipid peroxidation restores impaired Vascular Endothelial Growth Factor expression and stimulates wound healing and angiogenesis in genetically diabetic mouse. Diabettes.2001,50,667-674). Bir Hint baharatı olan zerdeçalda bulunan C ur c umin potent bir fenolik antioksidanttır. Farelerde tam kat eksizyonel kesi yaralarına Kurkumin uygulandığında ; yara bölgesinde hücresel proliferasyon, kollajen sentezi artmış ve yaralar belirgin bir biçimde hızlı iyileşmiştir. Tedavi görmüş farelerde Lipid Peroksitleri seviyeleri düşerken birçok ROS detoksifiye edici enzim seviyeleri ise artmıştır. (Panchatcharam M, Miriyala S, Gayathri VS et all. Curcumin improves wound healing by modulating collagen and decreasing reactive oxygen species. Molecular Cell Biochemistry.2006,290,87-96). Bir diğer çalışmada sıçan iskemik yaralarının serbest radikal bağlayıcısı Allopurinol ile tedavisi yara bölgesindeki kollajen içeriğini artırdığı gibi yara kırılma gücünü ( yara açılmasına karşı direnç gücünü) de artırmış; antioksidan tedavinin iskemik yaralardaki bozulmuş iyileşmeyi en azından kısmen düzelttiğini göstermiştir. (Şenel O, Çetinkale O,Özbay G,et all. Oxygen free radicals impair wound healing in ischemic rat skin. Annals of Plastic Surgery.1997,39,i516-523).

22 Tripeptid Glutatyon özellikle önemli bir “Endojen Antioksidan”dır. Tüm hücre tiplerinde 1 ila 10nM derişimlerinde bulunur. Hücresel redoks tamponu olarak görev yapıp, hücreleri endojen ve eksojen elektrofilik bileşiklerin toksititesine karşı korur. Bunun ötesinde Tripeptid Glutatyon ; Glutatyon Peroksidazlar ailesi için bir ko faktördür ve toksik maddelerin güvenli eliminasyonu için kojugasyonunda Glutatyon S Transferaz tarafından kullanılır. Glutatyon biyosentezinin hız kısıtlayıcı enzimi olan γ-Glutamil-Sistein Ligaz enziminin kimyasal inhibitörü ile tedavi yapılıp yara dokusunda Glutatyon seviyelerinde azalma görüldüğünde ; yara patlama direncinde güçlü bir azalma gözlenmiştir. (Adamson B, Schwartz D,Klugston P et all. Delayed repair: the role of Glutathion homeostasis in health and disease.Journal of Surgical Research. 1996,62,159-164). Buna karşılık genetik olarak diabetik farelerde yaraların Glutatyon ile yüzeyel tedavisi belirgin bir biçimde hızlı iyileşme ile sonuçlanmıştır. (Musalmah M, Nizrana MY, Fairuz AH et all. Comperative effects of palm Vitamin E and α-Tocopherol on healing and wound tissue antioxidant enzyme levels in diabetic rats. Lipids.2005,40,575-580). Bu sonuçlar Glutatyon’un yara iyileşmesi için yararlı olduğunu kuvvetle göstermektedir. Düşük moleküler ağırlıklı antioksidanlara ek olarak bir çok ROS detoksifiye edici enzim de hücresel redoks dengesinin düzenlenmesi için gereklidir.

23 SÜPEROKSİT DİSMUTAZLAR (SOD)ler Özellikle NADPH Oksidaz olmak üzere farklı oksidazlarla üretilen Süperoksit radikali anyonları (Oˉ²) ; Hidrojen Peroksit (H₂O₂) ve suya (H₂O) üç tip Süperoksit Dismutaz ile yıkılırlar: Sitozolik Bakır (Cu) yada Çinko (Zn) bağımlı Süperoksit Dizmutaz (SOD ₁). Mitokondriyal Manganez (Mn) bağımlı Süperoksit Dizmutaz (SOD ₂). Ekstraselüler (hücre dışı ) Süperoksit Dizmutaz (SOD ₃). Yazarlar normal fare derisinden ve iyileşmenin farklı evrelerindeki tam kat eksizyonel yaralardan elde edilen RNA ile Ribo Nükleotidaz (RNaz) koruyucu taramalar kullanılarak, iyileşen cilt yaralarında ( SOD ₁ ) ve ( SOD ₂ ) mRNA seviyelerinin en yüksek ekspresyon düzeyi erken enflamatuvar evre olmak üzere arttığını bulmuşlardır. Insitu Hibridizasyon ve Immun floresans da ; hiperproliferatif yara epidermisi bazal hücrelerinde olduğu gibi; granülasyon dokusundada SOD ₁ ekpresyonunu aç ı ğa çıkarmıştır. SOD ₂ hem bazal hem de suprabazal hücrelerde özellikle yara epidermisinde yüksek seviyelerde ekprese edilmekteydi, ancak nötrofillerde de bol olarak bulunmaktaydı. (Steiling H,Munz b, Werner Set all. Different types of ROS-scravenging enzymes are expressed during cutaneous wound repair. Experimental Cell Research. 1999,247,484-494).

24 SOD aktivitesi cilt yaralanmasına bağlı olarak azalmaktaydı ve bu aktivite 14gün içinde tamamı ile düzelmemekteydi. mRNA ve enzim aktivitesi arasındaki bu zıtlık verisi yara bölgesindeki yüksek ROS seviyeleri ile SOD enzim aktivitesinin inhibisyonu sonucuna bağlı olabilir. (Pigeolet E, Corbisier P, Houbion A et all. Glutathion Peroxydase,Superoxide Dismutase and Catalase inactivation by peroxides and oxygen derived free radicals. Mech Ageing Dev.1990,51,283-297). (Vessey DA, Lee KH. Inactivation of enzymes of the Glutathion Antioxidant System by treatment of cultured human Keratinocytes with Peroxides. Journal of Investişgative Dermatology. 1993,100,829-833). Bu hipotezle tutarlı olarak genç sıçanlarla karşılaştırıldığında yaşlı sıçanlardaki yara iyileşmesi bozukluğu SOD aktivitelerinde daha ileri bir azalmaya eşlik etmekteydi. (Rasik AM,Shukla A. Antioxidant status in delayed healing type wounds. International Journal of Experimental Pathology.2000,81,257-263). Bunun ötesinde Antioksidan tedavisi ; yara bölgesinde SOD’ların olduğu gibi Katalaz’ın, Glutatyon Peroksidaz’ın seviyelerinde de artışla sonuçlanmaktaydı. (Altavilla D, Saitta A, Cucinotta D et all. Inhibition of lipid peroxidation restores impaired Vascular Endothelial Growth Factor expression and stimulates wound healing and angiogenesis in genetically diabetic mouse. Diabettes.2001,50,667-674). SOD’ların yara tamirindeki fonksiyonlarını saptamak için iskemik sıçan yaraları rekombinant SOD’lar ile tedavi edilmiş; yara kırılma direnci artmış, yara ödemi azalmıştır. (Şenel O, Çetinkale O,Özbay G,et all. Oxygen free radicals impair wound healing in ischemic rat skin. Annals of Plastic Surgery.1997,39,i516-523).

25 Bir diğer çalışmada karboksimetilselüloz hidrojelleri hazırlanıp sığır SOD₁’ i ile yüklenmişlerdir. Sıçan yaralarına uygulandığında SOD-hidrojeli yara iyileşme hızını artırabilmekteydi. ( Chiumento A, Lamponi S, Barbucci R et all. Immobilizing Cu, Zn Superoxide Dismutase in hydrogels of Carboxy methyl cellulose improves its stability and wound healing properties. Biochemistry. 2006,71,1324-1328). Streptozotosin ile uyarılan Tip 1 Diabetli farelerde cilt üzerinden tek doz SOD₂ gen terapisi yara bölgesinde Superoksit düzeylerini azaltmış ve bu hayvanlarda gecikmiş iyileşmeyi normalize etmiştir. ( Luo JD, Wanng YY, Fu WL et all. Gene therapy of endothelial Nitric Oxide Synthase and Manganese Superoxide Dismutase restores delayed wound healing in type 1 diabetic mice. Circulation.2004,110,2484-2493). Yakın zamanda Superoksit azalmasının etkisini saptamak için bir iskemik cilt yarası modeli kullanılmıştır. Transjenik SOD₂ aşırı ifadesi yada bir SOD taklitcisinin verilmesi post iskemik defektlerde yeniden damar oluşumu ile kanlanmayı düzeltmiş ve yara dokusunun kurtulmasını artırmıştır. ( Ceradini DJ, Yao D, Grogan RH et all. Decreasing intracellular superoxide corrects defective ischemia induced new vessel formation in diabetic mice. Journal of Biological Chemistry.2008,283, 10930-10938). Bu çalışmalar birarada ele alındığında ; yara bölgesindeki Superoksit detoksifikasyonu ‘nun özellikle bozulmuş yara iyileşmesi koşullarında faydalı olduğunu göstermektedir.

26 KATALAZ ve GLUTATYON PEROKSİDAZLAR SOD(Super Oksit Dismutaz) tarafından Superoksit (Oˉ²) radikal iyonlarından oluşturulan Hidrojen Peroksit (H₂O₂) ; Katalaz yada Selenoenzim Glutatyon Peroksidaz (SeGpX), Fosfolipid Hidroperoksit Glutatyon Peroksidaz (PHGpX)’ı da içeren farklı peroksidazlar tarafından ileri detoksifiye edilebilir. SeGpX ( Selenoenzim Glutatyon Peroksidaz) ekspresyonu fare tam kat eksizyonel yaralarında hasara bağlı olarak da uyarılmış; buna karşılık Katalaz ve PHGpX (Fosfolipid Hidroperoksit Glutatyon Peroksidaz) mRNA seviyeleri yaralanmadan etkilenmemiştir. (Steiling H,Munz b, Werner Set all. Different types of ROS- scravenging enzymes are expressed during cutaneous wound repair. Experimental Cell Research. 1999,247,484- 494). Tüm bu enzimler özellikle hiperproliferatif yara epidermisinde yüksek seviyede ekprese edilmişler, ancak granulasyon dokusunda düşük seviyelerde de görülmüşlerdir. (Steiling H,Munz b, Werner Set all. Different types of ROS-scravenging enzymes are expressed during cutaneous wound repair. Experimental Cell Research. 1999,247,484-494). SOD₁ ve SOD₂ için bu ekspresyon şekli; Hidroksil Radikalleri (OHˉ) oluşumundan kaçınmak amacıyla ; SOD’ler tarafından oluşturulan Hidrojen Peroksit(H₂O₂)’nin hızla detoksifiye edildiğini gösterir bir biçimde benzerdir.

27 SOD’ler ile benzer durumda; Katalaz ve Glutatyon Peroksidaz aktivitelerinin olası ROS aracılıklı deaktivasyonlarına bağlı olarak sıçanlarda cilt yaralanmasına nedeni ile azamasıydı. (Shukla A, Rasik AM, Patnaik GK. Depletion of reduced Glutathione, Ascorbic Acid, Vitamin E and antioxidant defence enzymes in healing cutaneous wound. Free Radical Research. 1997,26, 93-101). Bu durum bağışıklığı baskılanmış sıçanlarda da; cilt yaralanması ardından iki gün içinde Katalaz ve Glutatyon Peroksidaz aktivitelerinde düşme şeklinde de saptandı. (Gupta A, Sing RI, Raghubir R et all. Anti oxidant status during cutaneous wound healing in immuno comprimised rats. Molecular Cell Biochemistry,2002,241,1-7). İlginç bir şekilde fare eksizyonel yaralarında; Katalaz’a Adenoviral gen verilmesi bozulmuş angiogenezine ve bozulmuş yara kapanmasına sebep olmuştur. (Roy S, Khanna S, Nallu K et all. Dermal wound healing is subject to redox control. Molecular Theraphy. 2006, 13, 211-220). Bu bulgular ; normal cilt yaralarında bulunan göreceli olarak düşük Hidrojen Peroksit (H₂O₂) düzeylerinin VEGF ( Vaskuler Endotel Büyüme Faktörü) uyarımı için ve diğer yara anjiogenezi aracıları için önemli olduğu fikrini vermektedir. ( Brauchle M, Funk JO, Kind P et all. Ultraviolet b and H₂O₂ are potent inducers of Vascular Endothelial Growth Factor expression in cultured Keratinocytes. Journal of Biological Chemistry. 1996,271,21793-21797). (Sen CK, Khanna S, Babior BM et all. Oxidant induced Vascular Endothelial Growth Factor expression in human Keratinocytes and cutaneous wound healing. Journal of Biological Chemistry.2002,277,33284-33290). Artmış ROS seviyeleri ile karakterize olan bozulmuş yara iyileşmesi modellerinde Katalaz Gen Terapisi’nin etkilerini saptamak ilginç olabilir.

28 PEROKSİREDOKSİNLER Peroksiredoksinler (Prdx) ; Hidrojen Peroksit (H₂O₂)’in ve geniş bir spekturum içindeki organik peroksitlerin indirgenmesini katalizleyen altı enzimi içeren bir ailedir. Peroksiredoksin 6 ( Prdx 6 ); Peroksinirat’ı da detoksifiye edebilir. Yazarlar yakın zamanda, farelerde tam kat eksizyonel yaralanmada Prdx 6 ‘nın ve daha az oranda da Prdx 4’ün ekspresyonunun arttığını ; buna karşılık yaralanma sonrası Prdx 1 ve Prdx 2 ‘nin ekspresyon seviyelerinin değişmediğini bulmuşlardır. (Kumin A, Schafer M, Epp N et all. Peroxiredoksin 6 i s required for blood vessel integrity in wounded skin. Journal of Cell Biology.2007,179,747-760). Peroksiredoksin 6 (Prdx 6) ’nın yara tamirindeki rolü bundan dolayı daha detaylı çalışılmıştır. Her ne kadar granulasyon dokusunun farklı hücreler de bu geni eksprese etse de ; in situ hibridizasyon kullanılarak yara epidermisindeki Keratinositler yarada Peroksiredoksin 6 (Prdx 6)’ nın ana kaynağı olarak tanımlanmışlardır. ( Munz B, Frank S, Hubner G et all. Anovel type of Glutathion Peroxidase : expression and regulation during wound repair. Biochemical Journal.1997,326(Pt 2),579-585).

29 Artmış Prdx 6 düzeylerinin, epidermisde yara tamiri işleminde yarattığı sonuçları saptayabilmek için yazarlar Keratinositlerinde Prdx 6 aşırı ekspresyonu yapan transgenik fare geliştirmişlerdir. Aşırı eksprese edilen enzim cilt morfogenezini ve dengesini değiştirmemiştir. Buna karşın yabani tip farede cilt yaralanmasında Prdx 6 aşırı ekspresyonu; yaşlanma ile görülen yara kapanmasındaki gecikmeyi tersine çevirmiştir. Bu çalışmalar Prdx 6’nın aşırı ekspresyonunun ; yara iyileşmesinde yaşa bağlı eksikliklerden de sorumlu olan oksidatif hasar birikiminden koruduğunu ifade etmektedir. ( Kumin A, Huber C, Rulicke T, Wolf E, Werner S. Peroxiredoksin 6 is a potent cytoprotective enzyme in the epidermis. American Journal of Pathology. 2006, 169,1194-1205). Cilt yara iyileşmesinde endojen Prdx 6’nın rolünü saptamak için Prdx 6 için hasarlandırılmış fare kullanılmıştır. Her ne kadar Prdx 6 en yüksek düzeylerde Keratinositlerde eksprese edilse de ; bu hücrelerdeki Prdx 6’nın eksikliğinin diğer ROS detoksifiye edici enzimler tarafından karşılanabileceğini gösteren bir şekilde yara epitelizasyonu etkilenmemiştir. Buna karşılık Prdx 6 için hasarlandırılmış farede granulasyon dokusunda ciddi hemoraji gözlenmiştir. Önemli olarak hemorajinin genişliği ; yara bölgesindeki Nitrotirosin positif hücrelerin varlığı kadar okside olmuş protein düzeyleri ile de saptanabilen oksidatif stres’in genişliği ile bağıntılıydı.(Şekil 2b),(Şekil 2c).

30 Ultrastrukturel düzeyde endoteliyal hücrelerin artmış apopitoz oranları ve aşırı hasarları ile belirmişti. Kültürü yapılmış endotel hücrelerinde Prdx 6 ‘nın siRNA aracılıklı hasarının ; bu hücrelerin ROS tedavisine hasasiyetini de artırmıştır. Prdx 6’nın kaybına bağlı hemorajinin endotel hücrelerinin kendinden mi, yoksa Prdx6 yetmezliği bulunan enflamatuvar hücreler tarafından üretilen artmış ROS seviyelerine mi bağlı olduğunu anlamak için; kemik iliği şimerik fareler yaratılıp bunları da yara iyileşmesi deneylerinde kullanmışlardır. (Wang HQ, Quan T, He T, Franke TF et all. Epidermal Growth Factor receptor dependent, NF-κβ independent activation of Phosphoinositol 3-Kinase /AKT pathway inhibits Ultraviolet irradiation induced Caspases 3-8and 9 in human Keratinocytes. Journal of Biological Chemistry.2003,278,45737-45745). Bunun ötesinde çığır açacak hemopoietik hücrelerle yerleşik hücreler arasında ROS aracılıklı çapraz iletişimde tanımlanmıştır. (Kumin A, Schafer M, Epp N et all. Peroxiredoksin 6 is required for blood vessel integrity in wounded skin.Journal of Cell Biology.2007,179,747-760).

31 HEMOKSİJENAZLAR Daha önce tanımlanan ROS(Reaktif Oksijen Türleri)’ni detoksifiye eden enzimlere ek olarak Hemoksijenazlar da ROS’a karşı koruma özelliği sergilerler. Hemoksijenazlar Hem’in ; Karbon monoksit (CO),Demir (Fe) ve daha sonra potent bir antioksidant olan Bilüribin’e indirgenen Biliverdin’e yıkılmasında hız kısıtlayıcı enzimlerdir. Üç farklı Hemoksijenaz(HO) isoformu tanımlanmıştır: Uyarılabilen isoform (HO-1) Çoğunlukla yapısal olan isoform (HO-2) ve zayıf enzimatik aktivitesi olan (HO-3). Fare tam kat eksizyonel yaralarında yazarlar yaralanmadan 1 gün sonra (HO-1)’in protein ve mRNA düzeylerinde güçlü bir artış bulmuşlardır. Yara tamamiyle iyileşinceye kadar bu ekspresyon düzeyleri ardışık bir şekilde düşmüşlerdir. Tersine (HO-2) ekspresyonu yaralanmadan etkilenmemiştir. Hemoksijenaz 1’ in (HO-1) en yüksek düzeyleri yara epitelindeki Keratinositlerde ve granulasyon dokusundaki enflamatuvar hücrelerde bulunmuştur. (Hanselmann C, Mauch C, Werner S. Hemoxygenase -1 : a novel player in cutaneous wound repair in Psoriasis ? Biochemistry Journal. 2001,353,459-466). Bu bulgular antioksidan olan Bilüribin’in oluşturulması yolu ile ; Hemoksijenaz 1 (HO-1)’in yaralanmış deride hücreleri ROS(Reaktif Oksijen Türleri)’dan koruyucu rolünü göstermektedir.

32 Diğer araştırmacılar Lökositler’in Hem ile yüklenip şişmesi ile sonuçlanan; cilt yaralarının kenarlarında güçlü bir Hem birikimi bulmuşlardır. Bu etki; Hemoksijenaz (HO) aktivitesinin farmakolojik baskılanmasıyla güçlü bir biçimde artırılır ki; bu da Hemoksijenazların aynı zamanda enflamasyonun azaltılmasında koruyucu bir rol sergilediğini de gösterir. (Wagener FA, Van Beurden HE, Van den Hoff JW,Adema GJ, Figdor CG. The Heme Heme Oxygenase System : a molecular switch in wound healing. Blood. 2003,102,521-528). Hemoksijenaz1(HO-1)’in yara iyileşmesindeki önemli rolü yakın zamanda(HO-1) için hasarlandırılmış fareler kullanılarak bulunmuştur. Bu hayvanlar yaralandıklarında gecikmiş yara kapanması ile sonuçlanan bozulmuş yara epitelizasyonu ve bozulmuş anjiogenez sergilemekteydiler. Hemoksijenaz 1 (HO-1)’in antioksidan aktivitesinin bu fenotipe katılıp katılmadığını saptamak geriye kalmıştır. (Deshane J, Chen S, Cabarello S, Grochot- Przeczek A, Was H, Li Calzi S et all. Stromal cell derivated factor 1 promotes angiogenesis via a Heme Oxygenase 1 dependent mechanism. Journal of Experimental Medicine. 2007,204,605-618 ).

33 SONUÇ Yakın zamandaki bir dizi çalışma yara iyileşme sürecinde Reaktif Oksijen Türleri (ROS)’nin önemli rolünü aydınlatmıştır. Bir yandan Reaktif Oksijen Türleri (ROS) saldırgan patojenlere karşı etkili savunma için gerekli iken; enfeksiyon yokluğunda bile ROS’ların düşük düzelerine bile hücreler arası sinyalizasyon ve anjiogenez için gereksinim duyulmaktadır. Buna karşın Reaktif Oksijen Türleri (ROS)’nin aşırı üretimi yada bu agresif moleküllerin bozulmuş detoksifikasyonu; kronik, iyileşmeyen yaraların patojenezinde önemli bir özellik olarak tanımlanan Oksidatif Stres’e neden olmaktadır. Bu nedenle normal temir işlemi için ROS üretimi ve detoksifikasyonunun sıkı düzenlenmesi zorunludur. Bu işleme katılan proteinlerin tanımlanması ve bunların in vivo fonksiyonel analizleri iyileşen yaralarda Redoks Dengesi’nin anahtar düzenleyicilerini halen tanımlanmıştır. Buna karşılık çoğu ek proteinin in vivo fonksiyonları ve bunların ROS üreten ve detoksifiye eden enzimlerle etkileşiminin incelenmeye gereksinimi vardır. Bu bilgi yara iyileşme bozukluklarının tedavisinde çığır açacak hedeflerin tanımlanması ile sonuçlanacaktır.