1 TÉCNICAS de LABORATORIO NEUROMUSCULAR con aplicabilidad clínica INMUNOLOGIA

2 OBJETIVOS Familiarizarse con las técnicas utilizadas comúnmenteDestacar sus utilidades, ventajas e inconvenientes Análisis crítico con ejemplos reales de artículos destacados

3 RESUMEN Inmunohistoquímica Técnicas basadas en células ELISADiagnóstica Investigación Screening autoanticuerpos Confirmación de reactividad Técnicas basadas en células Inmunocitoquímica Citometría de flujo ELISA Western-blot Cromatografía de capa fina

4 INMUNOHISTOQUÍMICA DIAGNÓSTICA

5 Inmunohistoquímica Inmunohistoquímica: es un procedimiento que se basa en la utilización de un anticuerpo específico, para la localización e identificación de un antígeno en una muestra tisular. 2 tipos de anticuerpos

6 Inmunohistoquímica Antígenos Anticuerpo 1° Anticuerpo 2°

7 Inmunohistoquímica Inmunofluorescencia directaInmunofluorescencia indirecta Utiliza un solo anticuerpo Utiliza un 2° anticuerpo conjugado Anticuerpo 2° Anticuerpo 1° Anticuerpo 1° Antígenos Antígenos

8 Marcado mediante enzimasInmunohistoquímica Marcado con fluorocromo Marcado mediante enzimas + sustrato

9 APLICACIONES InmunohistoquímicaDetectar la presencia/ausencia de una moleculas concretas en un tejido Detectar moleculas que están y no deberían estar Detectar moléculas que no están y deberían estar Analizar el patrón de tinción Si las moléculas están donde tienen que estar y en la proporción adecuada.

10 DISTROFINA

11 MHC I

12 INMUNOHISTOQUÍMICA INVESTIGACIÓN

13 UTILIDAD Enfermedad inmunes y no inmunes Enfermedades inmunesDemostrar la presencia de anomalias estructurales o la alteración del patrón de tinción de determinadas proteinas relacionadas con la fisiopatología de la enfermedad Enfermedades inmunes Demostrar que el suero/LCR de pacientes reacciona contra un tejido relevante para la enfermedad estudiada.

14 EJEMPLOS PRIMER CASO

15 EJEMPLOS SEGUNDO CASO

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17 Ensayos diagnósticos celulares (cell-based assays)

18 INMUNOCITOQUÍMICA CITOMETRÍA DE FLUJO

19 Cultivo celular y transfección

20 Tipos de Cultivo Primarios: provienen de una persona/animal y su crecimiento es limitado. Ej: musculares, endoteliales, neuronas… Líneas: Células immortalizadas, crecimiento ilimitado, amplia utilización en investigación. Ej: HEK, CHO, HeLa….

21 Cultivo de biopsias musculares de pacientesCultivo de explantes Separación con CD56+ Proliferación de mioblastos Diferenciación a miotubos

22 Inmunocitoquímica

23 Transfección: partículas lipídicas

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25 Procéso immunocitoquímicaCélula

26 Célula

27 Proyecto de busqueda de nuevos antígenos en CIDPContactin-1 CASPR1/Contactin-1 (Contactin1 complex) Neurofascin155 Serum Commercial Ab Merged Serum Commercial Ab Merged Serum Commercial Ab Merged

28 VENTAJAS ICC Expresión proteínas en su conformación nativaIncluye modificaciones post-traduccionales Ideal para proteinas de membrana Permite el estudio de proteinas humanas sobre líneas celulares humanas Permite valorar el patrón de tinción (aspectos cualitativos) Sencillo y relativamente barato. Puede utilizarse de la misma manera o con mínimos cambios para muchas proteínas.

29 DESVENTAJAS No es útil para complejos de proteínas o proteínas con interacciones complejas Diferencias post-traduccionales respecto a proteina en su tejido de origen (diferente glicosilación, splicing…) No cuantitativo No mecanizable, consume tiempo.

30 CITOMETRIA DE FLUJO

31 VENTAJAS En general las mismas que la ICC más CuantificableMecanizable

32 DESVENTAJAS Similares a la ICC, másNo permite análisis cualitativo (localización de la tinción…) Discrimina peor reactividad inespecífica

33 ELISA

34 ELISA ELISA: es un inmunoensayo para la cuantificación de un antígeno o anticuerpo mediante la inmovilización en una superficie sólida de un anticuerpo o antígeno, respectivamente.

35 ELISA Tipo Sandwich IndirectaDetección de anticuerpos anti-gangliósidos en suero

36 ELISA

37 ELISA

38 ELISA Dilución punto final (cuando deja de ser positivo)

39 Analisis resultados Dos formasDeterminación pacientes positivos en función de una señal umbral Mejor especificidad Comparación de grupos

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42 VENTAJAS Versátil. Válido para muchos tipos de ensayoGangliosidos Proteinas Acidos nucleicos Sencillo y barato. Permite muchas determinaciones en poco tiempo Muy bueno para moléculas sencillas, no dependientes de conformación, pero válido para moléculas dependientes de conformación Mayor sensibilidad que otras pruebas diagnósticas Permite titular lo sueros

43 INCONVENIENTES Resultados variables, muy dependiente de condiciones externas de temperatura, tiempos de incubación, el estado de la molécula analizada… Más reactividad inespecífica, especialmente con sueros. Falsos positivos No válido para moléculas muy dependientes de conformación, por ejemplo, con muchos dominios transmembrana Necesidad de proteinas recombinantes. Proteinas purificadas o ELISA de tejidos, muy sucios.

44 WESTERN BLOT

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46 WB para Disferlina Western blot Dysferlin Β- actin Control 1 250 150100 75 50 37 2 Marcador Dysferlin Β- actin

47 WB para distrofina Western blot 1 2 3 1 2 3 Distrofina ROD (Dys 2) Distrofina Control Paciente 1 Paciente 2 250KDa ROD (Dys 2) Carboxi (Dys 3) Dys 1 Dys 2 Dys 3

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49 CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

50 Características de los gangliósidosGlicoesfingolípidos: ceramida + uno o más azúcares (hexosas) Selección de algunos de los gangliósidos relevantes en las neuropatías (neuropatía motora multifocal y los síndromes de neurona motora inferior). 

51 TLC de gangliósidos lámina de aluminio con gel de sílice

52 TLC de gangliósidos

53 Técnicas de determinaciónCromatografía en capa fina No permite la cuantificación Mayor especificidad en la determinación Placa Cromatografía silica gel solución de gangliósidos standard revelada con resorcinol incubación con el suero del paciente anti-IgG/IgM humana marcada con peroxidasa revelado por quimioluminiscencia

54 Técnicas de determinaciónCromatografía en capa fina, patrones de reactividad

55 Interpretación de los resultadosDISIALOSIL

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59 INMUNOHISTOQUÍMICA EJERCICIO 1

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62 INMUNOCITOQUÍMICA EJERCICIO 2

63 NEURONAS DRG – CIDP ATAXICA

64 ELISA EJERCICIO 3

65 WESTERN-BLOT EJERCICIO 4

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67 Western blot 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Dysferlin Β- actin 237KDa 42KDa carril Dysferlin 237KDa Β- actin 42KDa carril Name DYSF ACTINA DYSF/ACT 100% expresión 1 control 59,06 163,56 0, 100 2 paciente 1 1,17 115,78 0, 2, 3 paciente 2 27,1 95,23 0, 78, 4 paciente 3 38,6 138,89 0, 76, 5 paciente 4 14,94 149,3 0, 27, 6 paciente 5 37,03 136,96 0, 74, 7 paciente 6 26,36 116,77 0, 62, 8 paciente 7 1,97 151,08 0, 3, 9 paciente 8 47,45 159,14 0, 82,

68 TLC EJERCICIO 5

69 AMAN

70 CANOMAD