1 Obtención de perfiles de ADN humano a partir de huellas dactilares depositadas sobre el Sello Dactilogenético ARFIS República Argentina

2 El “blanco” : El Stratum corneumEl Estrato Córneo Capa más superficial de la epidermis, conformada por finas capas de queratinocitos muertos que están en permanente recambio

3 Células epiteliales obtenidas Hoechst Nuclear StainVista en Microscopio de células humanas adheridas a un sello Dactilogénetico Arfis

4 Inhibidores de PCR

5 Quantifiler™ Kit TargetTotal Amplifiable Human DNA Human Reverse Transcriptase Gene (hTERT) Location 5p15.33 Amplicon Length: 62 bases Non-translated region (intron) Single copy target Additional Kit Information: Uses Minor Groove Binder –Non Fluorescent Quencher TaqMan Probe Developed on the ABI PRISM 7000 Sequence Detection System Kits will be validated on the ABI PRISM 7000 and 7900HT Sequence Detection Systems. Run in 96 well format.

6 Inhibición por componentes del sello dactilogenético – Utilidad del IPC

7 Extracción de ADN - Homogenato

8 Eliminación de inhibidores

9 DNA Sequencer 3130 (16x)

10 CE Capillaries

11 ¿Qué es Short Tandem Repeat Polymorphism (STR)? Polimorfismo - STRExisten regiones variables en las moléculas de ADN que se heredan. Esto se conoce como Polimorfismo. Las regiones de ADN con alto grado de polimorfismo son las que se utilizan para la identificación de individuos. Las repeticiones cortas en Tandem (STRs) son fragmentos cortos de ADN, normalmente con longitudes que van entre los 2 y los 5 pares de bases, que se repiten numerosas veces en secuencia “cabeza-cola”, por ejemplo la secuencia de 16 pares de bases “gatagatagatagata” representaría 4 copias del tetrámero “gata”. El polimorfismo de los STR ocurre en los diferentes números de “copias” que se repite el elemento, y esto es usado con fines identificatorios.

12

13 D7S280 Es D7S280 es uno de los marcadores usados, y se localiza en el cromosoma 7. 1 aatttttgta ttttttttag agacggggtt tcaccatgtt ggtcaggctg actatggagt 61 tattttaagg ttaatatata taaagggtat gatagaacac ttgtcatagt ttagaacgaa 121 ctaacgatag atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag atagacagat 181 tgatagtttt tttttatctc actaaatagt ctatagtaaa catttaatta ccaatatttg 241 gtgcaattct gtcaatgagg ataaatgtgg aatcgttata attcttaaga atatatattc 301 cctctgagtt tttgatacct cagattttaa ggcc

14

15 Resultados finales (n>200 muestras)AmpFlSTR Identifiler Kit (16 STRs autosómicos)

16 Ejemplo de Perfil Electroforético: Muestra DG-06 (24 pg/ul)

17

18 Recuperación de perfiles parcialesSe utilizó un método de purificación de los productos de PCR mediante un kit comercial basado en columnas de sílica, en la cual el ADN es adsorbido en presencia de alta concentración salina, y luego eluído de las mismas y concentrado mediante solución salina de muy baja concentración

19 Recuperación por purificación post PCR

20 Efecto de la purificación de los productos de PCRElectroferogramas

21 Muestra 1

22 Muestra 1

23 Muestra 1

24 Muestra 2

25 Muestra 2

26 Muestra 2

27 Muestra 2

28 UNIDAD GENETICA Captación de ADN por sistema de Sellos o Tira de la grafica Arfis Dactilogenetica Cuantificación Secuenciación PCR Registro de 16 marcadores genéticos NO CODIFICANTES en Base de Datos Central de cada uno de las personas ingresadas de manera Indubitada como muestra genética de REFERENCIA Base de datos para confrontación de Marcadores Genéticos de manera automática sean estos Indubitados o Dubitados El Software ARFIS Dactilogenético permite archivar el código genético de identificación humana por muestras tomadas desde un sello o tira Digigen de forma Indubitada hasta muestras tomadas por sangre – hisopado – huesos – pelos - tejidos – semen –muelas obtenidas de indicios Dubitados El código genético se obtiene de las sustancias orgánicas epiteliales que quedan adheridas en el sello al tomar las huellas dactilares en una capa autoadhesiva El código genético archivado por ARFIS Dactilogenético es compatible con las demás muestras tomadas por sangre, hisopos o evidencias orgánicas dubitadas y pueden ser confrontados en la base de datos. El mismo software Arfis Dactilogenético encripta y codifica los datos genéticos para que no puedan ser utilizados sin autorización oficial Carpeta de registros genéticos Anónimos y NO resueltos Grado de probabilidad de la muestra genética Obtenida

29 Formato Excel de datos exportados del Genemapper IDSample Name Marker Allele 1 Allele 2 01-BAL-01-i D8S1179 11 13 D21S11 29 33.2 D7S820 8 10 CSF1PO 12 D3S1358 16 17 TH01 7 9.3 D13S317 D16S539 D2S1338 23 D19S433 vWA 14 18 TPOX D18S51 AMEL X Y D5S818 FGA 24

30 Conclusiones generales ISe desarrolló un método de extracción de ADN del sello Dactilogenético Arfis que permite optimizar la cantidad y calidad de ADN obtenido a partir del sello dactilogenético En el 67 % de las muestras la cantidad de ADN obtenida fue superior a 50 pg/ul Se lograron eliminar los inhibidores proteicos/sintéticos presentes en la muestra original No se observa diferencia de rendimiento ligada al sexo No existe relación directa con el área de la huella, sino con las características individuales de descamación epidérmica

31 Conclusiones generales IILa purificación post PCR resultó muy efectiva para recuperar el perfil completo, ya que aumenta la altura de los picos de todos los marcadores, en forma totalmente reproducible En general este procedimiento mejora la calidad de TODOS los resultados obtenidos originalmente, pero solo debería ser usado en aquellos casos donde no se obtiene un perfil completo con buena calidad de resultados

32 UN PERFIL DE ADN POR SI SOLO NO TIENE USO POR QUE CARECE DE CONTEXTOMUESTRAS DE REFERENCIA ( LOCIS ) INDUBITADA UN PERFIL DE ADN POR SI SOLO NO TIENE USO POR QUE CARECE DE CONTEXTO EL ANALISIS DE ADN PARA PROPOSITOS DE IDENTIDAD SOLO ES VALIDO POR COMPARACION CONTRA MUESTRA DE REFERENCIA DIRECTA INDUBITADA ( Ejm: Contra marcadores “LOCIS” ) Guardados en una base de datos genética se compara contra : Evidencia Dubitada de escena del crimen “comparada” a sospechoso (s) en Casos forenses o Anónimos sin resolver Restos de victimas (terremotos, maremotos, tsunamis, etc. ID de desastres en masa ( Comparados a parientes biológicos ) Restos de Evidencias Dubitadas ( comparados contra muestras de referencia directa con BD de fuerzas armadas – Policiales etc.- )

33 VENTAJAS ADICIONALES Con el Sello Dactilogenético Arfis se obtiene un método de obtención de ADN NO CODIFICANTE que puede aplicarse a grandes poblaciones de forma inmediata y no INTRUSIVA .- ( No es lo mismo tomar una huella dactilar , que sacar Sangre o utilizar un Hisopo Bucal ) Al No utilizar el sello elementos punzantes ni invasivos. El SELLO es inviolable. El SELLO con la muestra de ADN se traslada sin necesidad de medios especiales de conservación y puede almacenarse en espacios reducidos, lo que permite adoptar cadenas de custodia de muestras eficaces y confiables. El SELLO es portable de manera individual 33

34 Reactivos/Consumibles Sello Dactilogentico ARFIS Elementos necesarios para un laboratorio que soporte una posible base de datos poblacional de ADN a base de huellas dactilares tomados con el sello Digigen Reactivos/Consumibles Sello Dactilogentico ARFIS Software ARFIS Dactilogenético para almacenamiento de perfiles genéticos Kit específico ARFIS para extracción de ADN a partir de huellas dactilares en el sello “Fingerprint DNA Finder” Kit comercial para análisis de STR.

35 Elementos necesarios para un laboratorio que soporte una posible base de datos poblacional de ADN a base de huellas dactilares Instrumentos Dispositivo especial para lisis celular Termociclador en tiempo real para cuantificación Termociclador autorizado para amplificación de ADN Secuenciador de ADN Equipamiento general de laboratorio.