1 Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznychEnzymologia-5 Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznych

2 Najważniejsze metody badania mechanizmów reakcjiOkreślanie struktury enzymu Modyfikacja chemiczna enzymu Ukierunkowana mutageneza genu kodującego enzym Detekcja intermediatów reakcji enzymatycznej Badanie kinetyki reakcji enzymatycznej

3 Zastosowanie badań strukturalnych do określania mechanizmów reakcjiMetody: niskotemperaturowa rentgenografia strukturalna, NMR Szczególne znaczenie – określanie struktury kompleksu enzymu z analogiem substratu lub analogiem stanu przejściowego Struktura kompleksu hydroksymetylotransferazy serynowej z adduktem substratu z koenzymem oraz analogiem drugiego substratu

4 Reakcja katalizowana przez karbamoilotransferazę asparaginianową Stan przejściowy Analog stanu przejściowego

5 Struktura kompleksu karbamoilotransferazy asparaginianowej z PALA

6 MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMUDziałanie na enzym związkiem chemicznym powodującym inaktywację Dwa podejścia: odczynniki specyficzne wobec grup funkcyjnych określonych reszt aminokwasowych; analogi substratu lub stanu przejściowego reakcji enzymatycznej zawierające reaktywne ugrupowania chemiczne (ang. affinity labeling) Cechy odczynnika modyfikującego: selektywne zablokowanie określonej grupy funkcyjnej charakter lokalny zmiany ograniczenie zawady przestrzennej

7 MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMUPojęcie reszty istotnej dla aktywności enzymu modyfikacja chemiczna reszty powoduje całkowitą utratę aktywności przez enzym; stechiometria inaktywacji 1 : 1; substrat lub inhibitor kompetytywny chronią enzym przed inaktywacją

8 Kinetyka inaktywacji enzymuln[Ea]t/[Ea]o t [Io] [I] > [Io] [I] < [Io] kobs [I] tga = k1

9 kobs [I]

10

11 Odczynniki reagujące specyficznie z łańcuchami bocznymi niektórych reszt aminokwasowych.

12 MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU  Odczynniki ukierunkowane na reszty cysteinylowe A. -halogenooctany i -halogenoacetamidy Warunki: pH  7; labilne w roztworach wodnych; reaktywność I>Br>>Cl; dla jodopochodnych rekcję należy prowadzić w ciemności B. N-podstawione imidy kwasu maleinowego Warunki: pH  7; możliwość śledzenia zaniku absorpcji przy  = 302 nm; dla NEM  = 620 M-1cm-1

13 C. Kwas 2-nitro-5-tiocyjanobenzoesowyWarunki: pH = 8.0; niezbyt duże nadmiary molowe odczynnika (1,5  do 2 ); dla wytworzonej S-cyjanopochodnej max = 330 nm,  = 7500 M-1cm-1 D. Odczynnik Ellmana – kwas 5,5’-ditiobis(5-nitrobenzoesowy) Używany do ilościowego oznaczania grup tiolowych.

14 MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Odczynnik ukierunkowany na reszty serylowe  Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)

15 MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU  Odczynniki ukierunkowane na reszty lizylowe  A. Imidoestry Warunki: długie czasy reakcji  B. Kwas 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowy Warunki: Barwny produkt podstawienia; max = 420 nm,  = M-1cm-1

16 C. Fosforan pirydoksaluWarunki: najwyższa selektywność; wytworzenie trwałego wiązania dopiero w wyniku redukcji zasady Schiffa; reakcję należy prowadzić w ciemności; cyjanoborowodorek preferowany wobec borowodorku bo można prowadzić reakcję w roztworze wodnym (uwaga: tylko w pH >7!)

17 MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Odczynniki ukierunkowane na reszty histydylowe A. Dietylopirowęglan Warunki: odczynnik specyficzny dla His w zakresie pH4,5 – 7; produkt modyfikacji absorbuje w UV - max = 240 nm,  = 3200 M-1cm-1; odczynnik nietrwały w roztworach wodnych; w pH 7 czas połowicznego rozpadu = 10 min; im niższe pH tym większa trwałość odczynnika

18 B. Róż Bengalski – odczynnik fotoutleniający Warunki: ograniczona specyficzność (możliwe utlenienie Cys, Met i Trp); reakcję prowadzi się w temp 0 - 4C naświetlając promieniowaniem w zakresie VIS

19 MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Odczynniki ukierunkowane na reszty tyrozylowe A. N-acetyloimidazol Warunki: duże nadmiary odczynnika. Unikać buforu Tris. Reakcja dość wolna  B. Tetranitrometan Warunki: można śledzić postęp reakcji przy  = 350 nm,  = M-1cm-1 (anion trinitrokarboniowy). Może zachodzić utlenienie cysteiny.

20 MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU  Odczynniki ukierunkowane na reszty tryptofanylowe A. N-bromoimid kwasu bursztynowego Warunki: reakcja w buforze octanowym; gwałtowny przebieg; ograniczona specyficzność (ulegają też Tyr, Cys. Met) B. Bromek 2-hydroksy-5-nitrobenzylu (BHNB) C. Sól dimetylosulfoniowa BHNB odczynnik rozpuszczalny w wodzie Warunki: duże nadmiary odczynnika (nawet 100 ); reakcja w ciemności; odczynnik słabo rozpuszczalny w wodzie

21 MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Odczynniki ukierunkowane na reszty Glu i Asp A. Rozpuszczalne w wodzie pochodne karbodiimidu Schemat przebiegu reakcji Warunki: reakcja specyficzna w pH 4 – 6; duże nadmiary odczynnika; jako aminę stosuje się najczęściej ester metylowy glicyny; w kwaśnym pH konkurencyjna reakcja hydrolizy jest bardzo wolna.

22 Izomeraza fosfotriozowaHIS95 N Lys12 NH3+ Glu165 O H HIS95 N + H-N Lys12 NH3+ Glu165 HIS95 N + H-N Lys12 NH3+ Glu165

23 MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMUIzomeraza fosfotriozowa

24 Mutageneza ukierunkowanaMutageneza to proces prowadzący do powstania mutacji, czyli dziedziczonej zmiany sekwencji nukleotydowej DNA Mutageneza ukierunkowana jest techniką umożliwiającą precyzyjne badanie białek: umożliwia zrozumienie, w jaki sposób białka ulegają fałdowaniu jak rozpoznają inne cząsteczki, katalizują reakcje. W przypadku ustalania aminokwasów biorących udział w funkcji katalitycznej, czy regulacyjnej enzymu jest to najlepsza metoda udowadniająca lub obalająca udział konkretnych aminokwasów w pełnieniu tych funkcji.

25 Zastosowanie ukierunkowanej mutagenezy do identyfikacji reszt istotnych dla aktywności enzymu Enzym syntaza GlcN-6-P Struktura przestrzenna enzymu Analiza porównawcza sekwencji syntazy GlcN-6-P z różnych źródeł podstawą selekcji reszt do ukierunkowanej mutagenezy

26 Zastosowanie ukierunkowanej mutagenezy do identyfikacji reszt istotnych dla aktywności enzymu Enzym syntaza GlcN-6-P Aktywność glutaminazowa: L-Gln + H2O  L-Glu + NH3 Aktywność izomerazowa: Fru-6-P  Glu-6-P Aktywność syntazowa: L-Gln + Fru-6-P  L-Glu + GlcN-6-P

27 Detekcja intermediatówNiektóre produkty przejściowe reakcji enzymatycznej są stosunkowo stabilne (głębokie minimum energetyczne) – istnieje możliwość detekcji metodami spektroskopowymi: spektrofluorymetria, NMR niskotemperaturowy; Początkowe etapy reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę Wyłapywanie intermediatów za pomocą reakcji chemicznej Redukcja produktu przejściowego w postaci zasady Schiffa prowadzi do powstania stabilnego adduktu

28 Informacje dotyczące mechanizmu działania enzymu, które można uzyskać z pomiarów kinetycznych Eksperyment Możliwe informacje Określanie zmian szybkości reakcji w zależności od stężenia substratu Określanie zależności parametrów kinetycznych od struktury substratu Inhibicja odwracalna Określanie zależności aktywności od zmian pH Badania kinetyki stanu nieustalonego Wyznaczanie parametrów kinetycznych; rozróżnianie mechanizmów reakcji dwusubstratowych Rozpoznanie czynników strukturalnych odpowiedzialnych za wiązanie substratu Informacje pomocne dla określenia struktury centrum aktywnego Określenie pKa reszt istotnych dla katalizy Wyznaczenie stałych szybkości etapów reakcji: detekcja kompleksów enzymu z substratem i/lub produktami przejściowymi

29 Zależność aktywności enzymu od zmian struktury substratuPapaina – proteinaza cysteinylowa Ala-Phe-Arg-Leu Ala-Phe-Arg Badania specyficzności substratowej papainy wobec syntetycznych oligopeptydów wykazały istnienie w centrum wiążącym substrat obecność 7 „subcentrów” S2 – specyficzne wobec L-Phe S1’ – stereospecyficzne dla L-aminokwasów, z preferencją dla L-Leu i L-Trp Tripeptyd Ala-Phe-Arg jest inhibitorem kompetytywnym enzymu Czy tetrapeptyd Ala-Phe-Arg-Leu jest także inhibitorem?

30 Zależność zmian aktywności enzymu od pHAnaliza kształtu zależności v = f(pH) daje możliwość wyznaczenia pKa reszt ulegających jonizacji, które są istotne dla aktywności enzymu Krzywa dzwonowa pH optimum = pKa reszty katalitycznej

31 -CO2H -COO- + H+ -ImH+ -Im + H+Analiza zależności pKa reszt jonizujących od polarności rozpuszczalnika pozwala na określenie stanu jonizacji reszty -CO2H -COO- + H+ W tym przypadku obniżenie polarności rozpuszczalnika jest niekorzystne dla dysocjacji. pKa rośnie przy obniżaniu polarności. -ImH+ -Im + H+ A jak w tym przypadku?

32

33 Kinetyka stanów nieustalonychSchemat aparatury do pomiarów kinetycznych metodą stopped flow

34 Kinetyka stanów nieustalonychWarunki pomiaru: stężenia enzymu i substratu na porównywalnym poziomie techniki pomiarowe umożliwiające określanie niewielkich zmian stężenia w krótkim czasie (ang. stopped flow) Przykład: reakcja wiązania NADH przez dehydrogenazę mleczanową. Pomiar zmian stężenia NADH metodą spektrofluorymetryczną przez 16 ms; Stężenia początkowe enzymu i NADH identyczne – 8 M. k1 E + NADH [E:NADH] k-1 Reakcja II rzędu, ale ponieważ [E] = [S], to połowiczny czas reakcji można wyrazić wzorem:  = 1/k [S]. Z eksperymentu otrzymano  = 2 ms k = 1/ [S] = 6,7  107 M-1 s-1 Ponieważ k1 >> k-1, to k = k1

35 Chymotrypsyna – triada katalityczna

36 Kinetyka hydrolizy octanu p-nitrofenylu przez chymotrypsynęFaza I – tworzenie produktu przejściowego - acyloenzymu Faza II – hydroliza produktu przejściowego