1 Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznychEnzymologia-6 Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznych Przykłady

2 Enzym hydrolityczny rozkładający peptydoglikan ściany komórkowej bakteriiLizozym Schemat struktury peptydoglikanu Reakcja katalizowana przez enzym Hydroliza wiązania glikozydowego między atomem węgla C-1 reszt kwasu N-acetylomuraminowego i atomęm C-4 N-acetyloglukozaminy

3 Model przestrzenny cząsteczki lizozymu

4 Wiązania wodorowe pomiędzy (NAG)3 i lizozymem

5 Sposób wiązania (NAG)6 z lizozymemKolor żółty - (NAG)6 ; kolor niebieski – reszty aminokwasowe enzymu; Kolor czerwony – reszty aminokwasowe enzymu biorące bezpośredni udział w katalizie

6 Struktura części centrum aktywnegolizozymu. Kolorem żółtym oznaczono atomy pierścieni D i E substratu (NAG)6

7 Badanie specyficzności substratowej lizozymuPorównanie szybkości hydrolizy oligomerów NAG NAG2 0 NAG NAG3 1 NAG NAG4 8 NAG Produkty hydrolizy: NAG6  NAG4 + NAG2

8 Analog substratu, laktonowa pochodna (NAG)4,wiąże się z enzymem razy silniej niż (NAG)4. Wniosek: związek jest analogiem stanu przejściowego

9 B C D A B C Obraz struktury kompleksu enzym:NAM-NAG-NAM.F B C D A B C D E F A B C Obraz struktury kompleksu enzym:NAM-NAG-NAM. Ligand zajmuje miejsce B-C-D, a nie A-B-C, bo NAM jest zbyt duży aby zająć miejsce C. NAM w miejscu D przyjmuje konformację półkrzesłową

10 Określenie miejsca hydrolizy substratuKtóre wiązanie ulega hydrolizie? Informacje wyjściowe: w peptydoglikanie hydrolizowane jest wiązanie NAM-NAG (NAG)3 nie ulega hydrolizie; NAM nie może zajmować miejsca C (zawada przestrzenna)

11 Ustalenie roli reszt katalitycznychProfil zależności szybkości reakcji od pH Klasyczna krzywa dzwonowa. Maksimum około pH = 5.0 Spadek aktywności po stronie alkalicznej – wynik jonizacji Glu-35 Spadek aktywności po stronie kwasowej – wynik protonowania Asp52 Modyfikacja chemiczna Estryfikacja Asp52 – całkowita utrata aktywności; związanie substratu chroni enzym przed inaktywacją

12 Mechanizm reakcji katalizowanej przez lizozymEtap I – protonowanie atomu tlenu wiązania glikozydowego przez Glu 35 Etap II – przyłączenie anionu OH- z wody do jonu karboniowego i H+ do grupy COO- reszty Glu 35

13 Chymotrypsyna Enzym proteolityczny, wytwarzany przez trzustkęw formie proenzymu (chymotrypsynogen). Chymotrypsyna należy do grupy proteaz serynowych Specyficzność substratowa ustalona na podstawie peptydów modelowych Reszta seryny 195 jest szczególnie reaktywna. Selektywna modyfikacja przez DIPF oraz PMSF

14 Modyfikacja chemiczna Ukierunkowana mutagenezaMutant Asp102Asn wykazuje kkat 5000 razy niższe niż enzym typu dzikiego TPCK – specyficzny inaktywator chymotrypsyny Ser195, His57 i Asp102 tworzą triadę katalityczną TPCK alkiluje resztę His 57

15 Struktura przestrzenna chymotrypsyny

16 Wiązanie substratu Hydrofobowa kieszeń chymotrypsyny;miejsce rozpoznania i wiązania substratu Porównanie miejsc wiązania substratu w niektórych proteazach serynowych

17 Określenie mechanizmu katalizyDetekcja intermediatów - acyloenzym Acyloenzym powstający w wyniku działania octanu p-nitrofenylu na chymotrypsynę można wyizolować, jeżeli reakcję prowadzi się w niskim pH

18 Określenie mechanizmu katalizyDetekcja intermediatów – tetraedryczny stan przejściowy 1. Niskotemperaturowy 13C NMR Przejściowy produkt reakcji można wykryć poprzez identyfikację sygnału pochodzącego od znakowanego atomu węgla 2. Inhibitory – analogi stanu przejściowego

19 Mechanizm reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę

20 Stabilizacja stanu przejściowego w centrum aktywnym

21 Analogi stanu przejściowego w medycynie

22 Tetraedryczny związek pośredni Stan przejściowyEnzym Tetraedryczny związek pośredni Stan przejściowy Stan przejściowy Analog stanu przejściowego Lepszy analog stanu przejściowego ale chemicznie niestabilny

23

24 Penicylina – analog stanu przejściowegoD-alanylo-D-alaniny