1 Organización espacial dentro del núcleoChr 12, 14 y Todos los Chr territorio aislado no Hepatocito raton fibroblasto humano es sólido.-canales nucleoplásmicos Chromosome territories- Meaburn & Misteli- Nature 445:379, 2007
2 CONCEPTO DE FABRICAS DE TRANSCRIPCIONVisualizacion de sitios de transcripcion sitios de transcripción/núcleo RNA naciente se marca por 15 min con biotina-CTP que luego se revela con 1er Ab y proteina A-oro de 9 nm. RNA pol II se marca en el recuadro con Ab con particulas de oro de 15 nm Iborra et al. J.Cell Science 109: 1427, 1996
3 CONCEPTO DE FABRICAS DE TRANSCRIPCIONSitios de transcripción vistos por microscopia de fluorescencia tinción general de DNA celulas incubadas 15 min con BrUTP-fluoresceina sitios por célula
4 Localización de factores de transcripciónCélulas HeLa Los principales factores de transcripción están localizados en numerosos dominios pequeños a lo largo del nucleoplasma BRG1 Oct1 TFIIH GR Grande et al J.Cell Sci. 110: 1781, 1997 E2F-1 TFIIF
5 Colocalizacion restringida de los TF con los sitios de transcripcion BRG1 Oct1 sitios transcrip: rojo factor: verde A TFIIH E2F1 B C D Grande et al J.Cell Sci. 110: 1781, 1997
6 RNA polimerasa II y sitios transcripciónBr-UTP rojo RNA pol 0 (fosforilada) verde (A) RNA pol II verde (B) A B RNA pol 0 (phospho) rojo verde TF C: BRG1 D: Oct1 E: TFIIH F: GR (glucocorticoid recep) C D E Correlacion: ++RNApol con Br-UTP -- factores transcripcion F Grande et al J.Cell Sci. 110: 1781, 1997
7 Comparación de focos de RNA pol II en tejidos y em MEFfocos RNA pol 4000 genes siendo transcriptos en células eritroides E10, embryonic blood; E14, fetal liver erythroid; AS, adult anemic spleen erythroid; Sp, normal adult spleen; Th, adult thymus; Br, fetal brain; MEF: mouse embryonic fibroblasts
8 Transcription factories are nuclear subcompartments that remain in the absence of transcription- Mitchell & Fraser Genes Dev : 20-25 Celulas fetales hepaticas sin tratar tratadas con DRB (inhibidor elongacion RNApol II) tratadas con golpe de calor (inhibidor iniciación) Conclusión. la RNApol II permanece en compartimentos discretos aun en ausencia de transcripción Figure 2. Punctate localization of RNAPII is maintained in the absence of transcription. (A) Immunofluorescence of RNAPII in untreated and DRB- and heat-shock-treated fetal liver nuclei (4H8 or H14 antibody; bar, 4 μm). (B) Average number of foci per optical section (4H8) in untreated and DRB- and heat-shock-treated nuclei (n > 45; P = ; error bars depict SEM). (C) RNAPII was detected by Western in the saponin supernatant (SS) and pellet (SP) using the ARNA-3 antibody. Coomassie staining of histones, retained in the pellet, and globin proteins, extracted by 1% saponin, shows equal loading.
9 Inhibición por DRB (5,6-dichlorobenzimidazole) Inhibición transcripción genes Hbb
10 Genes activos comparten sitios de transcripciónFrecuencia de transcripción de genes: RNA FISH (sondas intrónicas) Chr 7 celulas eritroides de bazo anémico Uros Hbb-b1 globina tipo beta Eraf : proteina estabilizadora de alfa hemoglobina Uros: uroporfirinogeno II sintetasa Igf2: insulin like growth factor 2 Kcnqlot1: long QT intronic transcript Hba: alpha globina (Chr 11) Conclusión: Los genes activos pasan por períodos on-off y muchos genes tienen mayores periodos de quiescencia que de actividad. En este caso Hbb-b1 estaria constantemente “activo”
11 Genes activos comparten sitios de transcripciónColocalización de genes transcriptos en el Chr 7 Doble RNA FISH - células eritroideas de bazo anemico células eritroideas de bazo anemico Hba Eraf Uros Igf2 Kcnqlot1 Hbb-1 Hbb-1 Hbb-1 Hbb-1 Hbb-1 Conclusión: varios genes activos en una región de alrededor de 40 Mb colocalizan con Hbb-1 a alta frecuencia
12 Genes activos comparten sitios de transcripciónLa colocalización entre genes está relacionada con su transcripción? células eritroideas de bazo anemico Parte 1-Los genes activos se asocian con focos de RNA pol II DNA inmunoFISH DNA Eraf RNApol II Ab RNA inmunoFISH RNA Hbb-1 RNApol II Ab porcentaje de alelos con señal de transcripción por RNA FISH ´porcentaje de loci que se solapan con RNAP II por DNA FISH Conclusión: alelos en activa transcripción están asociados con focos de RNApol II mientras que alelos temporariamente inactivos no lo están
13 Genes activos comparten sitios de transcripciónLa colocalización entre genes está relacionada con su transcripción? Parte 2- Los genes en activa transcripcion colocalizan en fábricas transcripcionales Triple marca DNA-inmunoFISH Hbb DNA FISH Eraf DNA FISH RNA pol II Ab Triple marca RNA-inmunoFISH Hbb RNA FISH Eraf RNA FISH RNA pol II Ab
14 Alejamiento de un gen activo de su territorioDNA FISH verde territorio chr 7 rojo: Hbb En el caso de Eraf que solo es activo el 29% del tiempo, se encuentra fuera de su territorio el 79% de los casos. Conclusión: Genes con potencial para ser transcriptos están ubicados preferencialmente fuera de sus territorios, pero esto solo no es sufienciente para ser transcriptos
15 Tecnología 3C (Capturing Chromosome Conformation)
16 Análisis de proximidad entre los genes determinada por 3CComparación de una célula eritoidea E con cerebro B
17 Modelo de ocupancia de genes en fabricas de transcripción en presencia y en ausencia de transcripción
18 Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by 4C- Simonis et al. Nature Genetics 38: 1348, 2006 Tecnologia 4C Los patrones de bandas amplificadas por PCR son similares en distintas muestras del mismo tejido y diferentes a los de otro tejido Figure 1 4C technology. (a) Outline of 4C procedure. Briefly, 3C analysis is performed as usual, but the PCR step is omitted. The 3C template contains bait (for example, a restriction fragment encompassing a gene) ligated to many different fragments (representing this gene’s genomic environment). The ligated fragments are cleaved by a frequently cutting secondary restriction enzyme and are subsequently religated to form small DNA circles that are amplified by inverse PCR (30 cycles) using bait-specific primers facing outward. (b) PCR results separated by gel electrophoresis from two independent fetal liver (L1, L2) and brain (B1, B2) samples. (c) Schematic representation of the location of the microarray probes. Probes were designed within 100 bp of HindIII sites. Thus, each probe analyzes one possible ligation partner
19 Interacciones de largo alcance intracromosomales del gen de beta-globina activa (celulas eritroides E14.5 ) e inactiva (cerebro E 14.5) El patrón del conjunto de genes con los cuales interactua Hbb en células donde se expresa es completamente distintos del de células en que está inactivo
20 Gen beta-globina activo interactúa con zonas de genes activos y beta-globina inactiva con zonas de genes inactivo
21 Ejemplo de interacciones intracromosomales del gen Rad23a de expresión constitutiva en todos los tejidos Conclusión: semejante patron de interacciones en los dos tejidos. La interacción se da con zonas de genes activos
22 Interacción intercromosomal de Rad23aConclusión a- las interacciones intercromosomales en distintos tejidos se conservan mayormente b- La gran mayoria de las interacciones intercromosomales con Rad23a corresponde a genes activos en higado y en cerebro embrionarios c-d: los valores de interacción más significativos se dan en zonas de alta densidad de genes
23 Similar active gene cluster in specialized transcription factories- Xu & Cook- J.Cell. Biol. 181: , 2008 Abordaje Objetivo: estudiar si la transcripción ocurre en sitios discretos (fábricas) conteniendo la maquinaria especializada y si esos sitios se especializan en transcribir diferentes tipos de genes
24 Los minicromosomas replicados se concentran en unos pocos focosA las 24 h hay unos 8000 minicrosomas, y unos 20 focos
25 Minicromosomas con promotores idénticos son dirigidos a las mismas fábricas mientras que distintos promotores van mayormente a diferentes fábricas
26 Genes similares del minicromosoma y del huésped comparten fábricasLos minicromosomas organizarán sus propias fábricas o comparten las fábricas que transcriben idénticos genes del huésped? II U2 , U2G ,3 box (II U2 ) II CMV , EGFP ,pA (II CMV ) Genes similares del minicromosoma y del huésped comparten fábricas Cells were transfected, grown for 8 h (rows 1 – 6), and treated with or without cross-linker. Active and inactive chromatin was separated by ChIP (using an antibody against trimethyl K4 in H3) and the proximity between selected genes was assessed by 3C.
27 Modelos