1 PAOLA ANDREA CARO HERNÁNDEZ Microbióloga Industrial PhD.

2 http://www.taringa.net/posts/ciencia-educacion/5359230/La-ciencias- naturales-en-T_.html ¿Cual fue la primera interacción microbio-hospedador conocida? Margulis L, Sagan D. Acquiring genomes. A theory of the origins of species. New York, NY:Basic Books, 2002. Margulis y la teoría endosimbiótica

3 Infect Immun 2000;68:6511-6518. Host-pathogen interactions:basic concepts of microbial commensalism, colonization,infection, and disease. Casadevall A, Pirofski L. Interacciones hospedador-microorganismo en el contexto de la patogenia microbiana

4 Traducido y modificado de: Nat Rev Microbiol. 2004 Dec;2(12):933-45. The evolution of chronic infection strategies in the alpha-proteobacteria. Batut J, Andersson SG, O'Callaghan D.Batut J Andersson SGO'Callaghan D Infección crónica bacteriana Primer contacto con la célula hospedadora Adherencia e invasión Vida en el medio ambiente Establecimiento dentro de la célula hospedadora Evitando la defensa del hospedador Establecimiento dentro de la célula hospedadora Adaptación al medioambiente Extendiendo el nicho Modulando la biología del hospedador Extendiendo el nicho Multiplicación y supervivencia en el nicho de replicación

5 Nat Rev Microbiol. 2004 Dec;2(12):933-45. The evolution of chronic infection strategies in the alpha-proteobacteria. Batut J, Andersson SG, O'Callaghan D.Batut JAndersson SGO'Callaghan D α-Proteobacterias patógenas

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7 Brucella melitensis Brucella suis Brucella abortus Brucella canis Brucella ovis Brucella neotomae Brucella ceti Brucella pinnipedialis Brucella microti Género Brucella spp.

8 Factores de virulencia involucrados con la interacción Brucella-célula hospedadora virB, OMPs

9 La envoltura célular de Brucella spp. Int J Microbiol. 2010;2010:124509. Epub 2010 Dec 1. Importance of Lipopolysaccharide and Cyclic β-1,2- Glucans in Brucella-Mammalian Infections. Haag AFHaag AF, Myka KK, Arnold MF, Caro-Hernández P, Ferguson GP.Myka KKArnold MFCaro-Hernández P Ferguson GP OMP

10 B. ovis Proteínas de membrana externa (OMPs)  Cepa virulenta que no presenta cadenas O  Las OMPs podrían tener mayor relevancia en el proceso infeccioso

11 Omp31b Omp25b Omp25d Omp25c Omp22 (Omp3b) Relaciones entre las proteínas de la familia Omp25/Omp31 (Salhi et al. 2003)2510025b38100 25c3965100 25d415860100 3130353736100 31b2938363767100 22252423242626100 Omps2525b25c25d3131b22 pI6.64.64.69.25.14.88.1 % Identidad Omp25 Omp31 Omp25c Omp25d Omp25b Omp31b Omp22 10 PAM Omp25 Omp31 Proteínas de membrana externa de la familia Omp25/Omp31 del género Brucella

12 Presencia de las OMPs de la familia Omp25/Omp31 en el género Brucella Omp31Omp31bOmp25Omp25bOmp25cOmp25dOmp22 B. melitensis +-+++++ B. abortus -++-+++ B. suis B. neotomae +++++++ B. ovis +-+-+++ B. canis +-+-+++ B. pinnipediae +++-+++ B. cetaceae (mayoría de cepas) +++-+++ B. cetaceae (4 cepas) +++-++-? Extraído de Vizcaíno et al. 2004 Microbes Infect.;6 (9): 821-34 (2004). Vizcaino N, Caro-Hernández P, Cloeckaert A, Fernandez-Lago L.. DNA polymorphism in the omp25/omp31 family of Brucella spp.: identification of a 1.7-kb inversion in Brucella cetaceae and of a 15.1-kb genomic island, absent from Brucella ovis, related to the synthesis of smooth lipopolysaccharide.Vizcaino N, Caro-Hernández P, Cloeckaert A, Fernandez-Lago L.

13  Obtención de anticuerpos policlonales en conejo  Obtención de cepas mutantes y complementadas en B. ovis PA  Detección inmunológica mediante Western blot Evaluación de la antigenicidad de las OMPs de la familia Omp25/Omp31 en B. ovis

14 Obtención de anticuerpos policlonales frente a las OMPs de la familia Omp25/Omp31 INÓCULO células suspensión D. O. = 6 Adyuvante Incompleto de Freund 1 SEMANA 1ª inoculación 2ª inoculación3ª inoculación Obtención de suero Sin adyuvante Adyuvante Completo de Freund Punción cardiaca IntradérmicaSubcutánea IPTG E. coli Adsorción de sueros

15 kan r ∆omp22 Cepas kan r, sac r and amp s Inactivación del gen omp22 Recombinación homologa dobleDenominación Genotipo relevante ∆omp31  omp31, kan r ∆omp25 omp25:: kan r ∆omp25c  omp25c, kan r ∆omp25d  omp25d, kan r ∆omp22  omp22, kan r pNV22-1 (9347 pb) sacB omp22 inactivado kan r Amp r 2 RsrII StuI omp22 1 Cromosoma DE B. ovis PA

16 pCVD442 pNV22-I III+VI pb 5148 4268 3550 1904 1766 1375 MarcadorPA22-IΔ22PA22-IΔ22 Caracterización genotípica 2176 2690 pb PAΔ2222-I IV III

17 Pruebas clásicas Prueba B. ovis PA ∆omp ∆omp ∆omp-Com ∆omp-Com Necesidad de suero +++ Necesidad de CO2 +++ Catalasa +++ Oxidasa --- Actividad Ureasa --- Aglutinación Acriflavina +++ Tinción Cristal Violeta Oxalato +++ Tb --- Wb --- Lisis fagos Iz --- R/C +++ Crecimiento en Tionina +++ presencia de Fucsina --- colorantes Safranina --- Aglutinación A --- M ---

18 Omp31Omp31bOmp25Omp25bOmp25cOmp25dOmp22 B. ovis PA +-+-+-+ ∆ omp25 +---+-+ ∆ omp25c +-+---+ ∆ omp25d +-+-+-+ ∆ omp22 +-+-+-- ∆ omp31 --+-+-+ ∆ omp25 com +-+-+-+ ∆ omp25c com +-+-+-+ ∆ omp25d com +-+-+-+ ∆ omp22 com +-+-+-- B. ovis PA 25b com +-+++-+ B. ovis PA 31b com +++-+-+ Western blot Vet Microbiol. 28; 137 (1-2): 74-82. (2009) Martín-Martín AI, Caro-Hernández P, Sancho P, Tejedor C, Cloeckaert A, Fernández-Lago L, Vizcaíno N. (2009). Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25/Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species. Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25/Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species.

19 21,5 31 kDa Suero anti-Omp25c MP Omp25cOmp25c Omp25 Δ25 Com PA Δ25cCom Omp25 Vet Microbiol. 28; 137 (1-2): 74-82. (2009) Martín-Martín AI, Caro-Hernández P, Sancho P, Tejedor C, Cloeckaert A, Fernández-Lago L, Vizcaíno N. (2009). Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25/Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species. Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25/Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species.

20 Efecto de la inactivación de cada uno de los genes de la familia omp25/omp31 sobre las propiedades de la membrana. Microscopia electrónica de transmisión Auto aglutinación Porcentaje de supervivencia a Polimixina B, Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero

21 Papel de las OMPs de la familia Omp25/Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B. ovis PA % Supervivencia (media ± DS de 3 experimentos)Diámetro zona de inhibición CepaPolimixina BDesoxicolato de NaSuero no inmune(media ± DS.) (1 mg/ml)(0.1 mg/ml)de carneroH 2 O 2 30% B. abortus RB51 0.00 ± 0.00 88.69±5.4525.734±4.844.28±0.11 B. ovis PA 69.59±5.2689.34±9.385.52±5,205.04±0.05 ∆omp31 70.07±13.8375.51±20.9764.43±6.976.23±0.11 ∆omp25 75.73±22.1363.81±3.9871.67±2.895.88±0.02 ∆omp25c 27.70±11.6539.21±7.9255.68±7.325.88±0.15 ∆omp25d 61.16±8.9355.44±21.6954.053±7.426.05±0.07 ∆omp22 52.74±3.9730.68±3.625.38±3.985.90±0.25 Infect Immun. 75 (8): 4050-61 (2007). Role of the Omp25/Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernández P, Fernandez-Lago L, de Miguel MJ, Martin-Martin AI, Cloeckaert A, Grillo MJ, Vizcaino NCaro-Hernández P, Fernandez-Lago L, de Miguel MJ, Martin-Martin AI, Cloeckaert A, Grillo MJ, Vizcaino N

22 Evaluación de virulencia en el modelo del ratón BALB/c Vía de Inoculación Intraperitoneal Intraperitoneal Dosis inoculada 5x10 6 UFC/ratón 5x10 6 UFC/ratón Ratones BALB/c 35 ratones/cepa 35 ratones/cepa Semanas de sacrificio Ratones sacrificados 1, 2, 3, 5, 7, 9 y 11 p.i. 1, 2, 3, 5, 7, 9 y 11 p.i.n=5 Infect Immun. 75 (8): 4050-61 (2007). Role of the Omp25/Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernández P, Fernandez-Lago L, de Miguel MJ, Martin-Martin AI, Cloeckaert A, Grillo MJ, Vizcaino NCaro-Hernández P, Fernandez-Lago L, de Miguel MJ, Martin-Martin AI, Cloeckaert A, Grillo MJ, Vizcaino N

23 Análisis de la implicación de las proteínas de la familia Omp25/Omp31 en la virulencia de B. ovis Análisis estadístico PLSD de Fisher Infect Immun. 75 (8): 4050-61 (2007). Role of the Omp25/Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernández P, Fernandez-Lago L, de Miguel MJ, Martin-Martin AI, Cloeckaert A, Grillo MJ, Vizcaino NCaro-Hernández P, Fernandez-Lago L, de Miguel MJ, Martin-Martin AI, Cloeckaert A, Grillo MJ, Vizcaino N

24  La proteína Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B. ovis PA Análisis estadístico PLSD de Fischer Análisis estadístico PLSD de Fisher Infect Immun. 75 (8): 4050-61 (2007). Role of the Omp25/Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernández P, Fernandez-Lago L, de Miguel MJ, Martin-Martin AI, Cloeckaert A, Grillo MJ, Vizcaino NCaro-Hernández P, Fernandez-Lago L, de Miguel MJ, Martin-Martin AI, Cloeckaert A, Grillo MJ, Vizcaino N Análisis de la implicación de las proteínas de la familia Omp25/Omp31 en la virulencia de B. ovis

25 Infect Immun. 75 (8): 4050-61 (2007). Role of the Omp25/Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernández P, Fernandez-Lago L, de Miguel MJ, Martin-Martin AI, Cloeckaert A, Grillo MJ, Vizcaino NCaro-Hernández P, Fernandez-Lago L, de Miguel MJ, Martin-Martin AI, Cloeckaert A, Grillo MJ, Vizcaino N Análisis de la implicación de las proteínas de la familia Omp25/Omp31 en la virulencia de B. ovis

26 Las proteínas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferación en células HeLa y en macrófagos murinos J774A.1 Microbes Infect. 10 (6): 706-10 (2008). Importance of the Omp25/Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B. ovis in murine macrophages and HeLa cells. Martín-Martín AI, Caro-Hernández P, Orduña A, Vizcaíno N, Fernández-Lago LImportance of the Omp25/Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B. ovis in murine macrophages and HeLa cells. Análisis de la implicación de las proteínas de la familia Omp25/Omp31 en la virulencia de B. ovis

27 Susceptibilidad al suero no inmune de carnero Infect Immun. 75 (8): 4050-61 (2007). Role of the Omp25/Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernández P, Fernandez-Lago L, de Miguel MJ, Martin-Martin AI, Cloeckaert A, Grillo MJ, Vizcaino NCaro-Hernández P, Fernandez-Lago L, de Miguel MJ, Martin-Martin AI, Cloeckaert A, Grillo MJ, Vizcaino N

28 CRECIMIENTO IN VITRO Medida de la D.O. 600 nm Recuentos UFC/ml Infect Immun. 75 (8): 4050-61 (2007). Role of the Omp25/Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernández P, Fernandez-Lago L, de Miguel MJ, Martin-Martin AI, Cloeckaert A, Grillo MJ, Vizcaino NCaro-Hernández P, Fernandez-Lago L, de Miguel MJ, Martin-Martin AI, Cloeckaert A, Grillo MJ, Vizcaino N

29 CONCLUSIONES  Con excepción de la proteína Omp25d, las OMPs de la familia Omp25/Omp31 de Brucella spp. son antigénicas. Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa.  El balance de los miembros de la familia Omp25/Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B. ovis.  Las proteínas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B. ovis en ratón, por lo que sería interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B. ovis en carneros y también su implicación en la virulencia de otras especies del género Brucella.

30 “El genoma de B. suis revela fundamentales similaridades entre patógenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantas” Paulsen, IT et al. (2002) PNAS 99 (20): 13148-53 Uso de la interacción Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigación de las bases moleculares de la interacción Bacteria-Hospedador

31 López-Lara, I. M. Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas. Asociación Mexicana de Microbiología.Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Paralelo entre la vida intracellular de S. meliloti y Brucella spp. Flavonoides Adherencia Enroscamiento Penetración Infección Desarrollo del nódulo Nódulo maduro que contiene bacteroide

32 La proteína BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la célula hospedadora Aguda Crónica Brucella dentro del macrófago Enfermedad Mutante bacA Bacteria Bacteroide Mutante bacA Simbiosis Sinorhizobium en la célula vegetal LeVier, KL et al. (2000) Science 287: 2492-93

33 PROPUESTA INVESTIGATIVA Estandarización del modelo de infección bacteria leguminosa Objetivos Aislamiento y caracterización de cepas autoctonas de Rhizobium spp. Secuenciación profunda Análisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp. Microbiología Fenotipicación Biología Molecular Bioinformática Construcción de mutantes Rhizobium Quimeras Brucella-Rhizobium Caracterización fenotípica y genotípica Biología Molecular Microbiología Área de Investigación

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