1 Pedro Bosch Mendoza 13 Feb. 2014Cromóforos catiónicos intercalantes de DNA: Fluorescencia y selectividad de secuencia Pedro Bosch Mendoza 13 Feb. 2014
2 Introducción RT-PCR Ensayos de fluorescencia Compuestos fluorescentesQuimioteca de compuestos catiónicos Ensayos de intercalación Intercalantes de ADN Ensayos de selectividad de secuencia Ensayos de fluorescencia Compuestos fluorescentes Bases estructurales de selectividad Sondas de ADN RT-PCR Tinción celular Ensayos de actividad antiproliferativa Potencial antitumoral
3 Introducción Quinolizinio Sistemas tri , tetra y pentacíclicosVariación de forma y tamaño
4 Síntesis Condensación de WestphalWestphal, O.; Jahn, K.; Heffe, W. Arch. Pharm. 1961, 294, J. J. Vaquero, J. Alvarez-Builla, Adv. Nitrogen Heterocycles, 2000, F. Delgado, L. Linares, R. Alajarín, J. Alvarez-Builla, J.J. Vaquero, Org. Lettt. 2006,
5 Síntesis Metátesis de cierre de anillo Grubbs 2º generaciónHoveyda-Grubbs Núñez; B. Abarca; A. M. Cuadro; J. Alvarez-Builla; J. J. Vaquero. J. Org. Chem. 74, 4166 – 4176, 2009 A. Nuñez, A. M. Cuadro, J. Alvarez-Builla, J. J. Vaquero. Org. Lett. 2007, 9, A. Núñez; A. M. Cuadro; J. Alvarez-Builla; J. J. Vaquero. Chem. Comm. 3, 2690 – 2692, 2006
6 Ensayo de selectividad Quimioteca de compuestos catiónicosEnsayos Intercalación / selectividad de secuencia de ADN Curvas de fusión Oligonucleótidos de secuencia definida Ligando unido: aumento de temperatura de fusión Intercalantes de ADN Ensayo de selectividad de secuencia ADN (preferencia AT vs GC) Ensayo de Intercalación con el ADN Selectividad vs estructura Quimioteca de compuestos catiónicos V. García-Hernández, Juan J. Vaquero, F. Gago, A. Domingo A highly sensitive and miniaturized fluorescence-based DNA melting assay for DNA-binding ligand screening and profiling Enviado A. Domingo, V. García-Hérnandez, J. J. Vaquero, PCT/ES , 2010
7 Ensayos Intercalación / selectividad de secuencia de ADNCurvas de fusión Oligonucleótidos de secuencia definida Ligando unido: aumento de temperatura de fusión V. García-Hernández, Juan J. Vaquero, F. Gago, A. Domingo A highly sensitive and miniaturized fluorescence-based DNA melting assay for DNA-binding ligand screening and profiling Enviado A. Domingo, V. García-Hérnandez, J. J. Vaquero, PCT/ES , 2010
8 Ensayos Intercalación / selectividad de secuencia de ADN Unión ADNSelectividad GC ó AT 1 No --- 2 Sí AT 3 Muy débil No existe 4 5 6 Unión ADN Selectividad GC ó AT 7 No --- 8 9 Débil AT 10 11 Muy débil 12 Sí
9 Ensayos Fluorescencia: Máx. emisión Eficiencia cuántica 1 442 0,33 2544 < 0,05 3 464 4 461 0,14 5 361 0,23 6 467 0,15 Máx. emisión Eficiencia cuántica 7 353 0,18 8 437 < 0,05 9 419 0,15 10 400 0,35 11 398 0,31 12 450 0,25
10 Ensayos 6 12 1
11 Valoración FluorescenciaMateriales Cromóforos (5% DMSO, 3,9·10-5M) DNA Timo bovino (10 µl, 4,1·10-3M) Procedimiento Adición de alicuotas de DNA sobre disolución de cromóforo Tiempo de intercalación: 10 min Error correspondiente a dilución menor del 5% Ratio 1:12 cromóforo/DNA
12 Valoración FluorescenciaGráficas 12 1
13 Valoración Fluorescencia12 Gráficas Área bajo la curva Anisotropía de fluorescencia Constante de unión al DNA Kb= (6.92.6) 104 M-1 Pares de bases por cromóforo (n): 5.90.3 1
14 Dicroísmo circular inducidoLuz polarizada en un plano Plano formado por 2 componentes en fase Dicroísmo circular inducido: Transferencia de asimetría Cercanía en el espacio Molécula capaz absorber
15 Dicroísmo circular inducidoGráficas Señal correspondiente al apilamiento de bases y a helicidad. CD aumenta en presencia de cromóforo Este cambio sugiere intercalación
16 Dicroísmo circular inducidoGráficas
17 Nuevos cromóforos Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998Dyes and pigments 96 (2013)
18 Nuevos cromóforos Dyes and pigments 96 (2013)
19 Nuevos cromóforos Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998
20 Nuevos cromóforos Tesis Doctoral Dr. Jorge Siro 1998
21 Nuevos cromóforos Perspectivas Cromóforos funcionalizadosCompuestos con un aumento de fluorescencia al estar unidos al DNA
22 Síntesis del Híbrido Losartán-inhibidor de RAS
23 Híbrido de Losartán Introducción Objetivo Losartán Inhibidor de RASSistema Renina-Angiotensina-Aldosterona ARAII Inhibidor de RAS Proteína reguladora Proteína G monomérica Activación y proliferación Objetivo Estrategia
24 Híbrido de Losartán Síntesis del inhibidor de RASJ. Med. Chem. 2010, 53, 6838–6850
25 Híbrido de Losartán Oxidación de LosartánA. Avenoza et al. Tetrahedron: Asymmetry 12 (2001)
26 Híbrido de Losartán Síntesis del HíbridoTesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008
27 Híbrido de Losartán Desprotección del HíbridoTesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008
28 Híbrido de Losartán PerspectivasDesprotección del grupo tritilo utilizando Pt/C 5% Se evita la deshalogenación. Tesis Doctoral Dr. Gonzalo García Navazo 2008