1 PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKANukleotydy i kwasy nukleinowe

2 Nukleotydy N O zasada cukier CH2 P O- reszta kwasu ortofosforowego1 2 3 4 5 6 PIRYMIDYNA cytozyna tymina uracyl 7 8 9 PURYNA adenina guanina O N zasada cukier 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ CH2 P O- reszta kwasu ortofosforowego OH H O HOCH2 ryboza 2-deoksyryboza

3 Nukleotydy N O N O CH2 P O- nukleotyd CH2 P O O-1’ 2’ 3’ 4’ 5’ CH2 P O- nukleotyd CH2 P O O- monofoforan nukleozydu wiązanie estrowe wiązanie N-glikozydowe CH2 P O O- difoforan nukleozydu O N 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ CH2OH nukleozyd CH2 P O O- trifoforan nukleozydu

4 Fragment łańcucha kwasu nukleinowegocukier 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ fosforan N zasada koniec 5’ łańcucha wiązanie fosfodiestrowe koniec 3’ łańcucha OH

5 DNA RNA Kwasy nukleinowe kwas deoksyrybonukleinowy kwas rybonukleinowybierze udział w rozkodowywaniu informacji zawartej w DNA koduje informację o budowie i działaniu całego organizmu

6 DNA dATP, dGTP, dCTP, dTTP RNA ATP, GTP, CTP, UTP CH2 P O O-monofoforan nukleozydu CH2 P O O- trifoforan nukleozydu DNA dATP, dGTP, dCTP, dTTP RNA ATP, GTP, CTP, UTP

7 Podwójna helisa DNA G C A T komplementarne parowanie zasad

8 Enzymy restrykcyjne 5’ GGTACCAATTCAAAGCTTATG 3’3’ CCATGGTTAAGTTTCGAATAC 5’ Alu I AGCT TCGA 5’ CTTATG 3’ 3’ GAATAC 5’ 5’ GGTACCAATTCAAAG 3’ 3’ CCATGGTTAAGTTTC 5’ Hind III AAGCTT TTCGAA 5’ GGTACCAATTCAA 3’ 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA 5’ 5’AGCTTATG 3’ 3’ATAC 5’ Kpn I GGTACC CCATGG 5’ GGTAC 3’ 3’ C 5’ 5’CAATTCAAAGCTTATG 3’ 3’ CATGGTTAAGTTTCGAATAC 5’

9 |||||||||||||||||||| 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA AGCTTATG 3’ | ATAC 5’ 5’ GGTACCAATTCAA |||||||||||||||||||| 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA AGCTTATG 3’ | ATAC 5’ 5’ GGTACCAATTCAA |||||||||||||||||||| 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA AGCTTATG 3’ | ATAC 5’ Hind III AAGCTT TTCGAA 5’ GGTACCAATTCAA 3’ ||||||||||||| 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA 5’ 5’AGCTTATG 3’ ||| 3’ATAC 5’ ligaza 5’ GGTACCAATTCAA |||||||||||||||||||| 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA AGCTTATG 3’ | ATAC 5’

10 Klonowanie DNA DNA zawierający wstawkę, którą chcemy przeklonowaćtrawienie enzymem restrykcyjnym wektor wstawka trawienie enzymem restrykcyjnym ligacja wektora ze wstawką plazmid ze wstawką gotowy do wprowadzenia do bakterii

11 Hybrydyzacja jednoniciowa wyznakowana sonda komplementarnamieszanina jednoniciowych cząsteczek DNA jednoniciowa wyznakowana sonda komplementarna do cząsteczki A hybrydyzacja w warunkach ostrych w warunkach łagodnych tylko cząsteczka A tworzy stabilną dwuniciową cząsteczkę cząsteczki A, C i E tworzą stabilne dwuniciowe cząsteczki

12 Hybrydyzacja denaturacja DNA w celuuzyskania jednoniciowych cząsteczek inkubacja błony z jednoniciową wyznakowaną radioaktywnie sondą DNA

13 Sekwencjonowanie DNA GCATATGTCAGTCCAG 5’ 3’ dwuniciowy DNACGTATACAGTCAGGTC 5’ 3’ denaturacja jednoniciowy DNA (matryca do sekwencjonowania) GCATATGTCAGTCCAG CGTATACAGTCAGGTC 5’ 3’ GCAT 5’ 3’ przyłączenie znakowanego startera GCAT CGTATACAGTCAGGTC 5’ 3’

14 Sekwencjonowanie DNA + GCAT CGTATACAGTCAGGTC 5’ 3’dATP, dTTP, dCTP, dGTP + ddATP ddGTP ddCTP ddTTP polimeraza DNA GCAT A ATGTCA ATGTCAGTCCA AT ATGT ATGTCAGT ATGTC ATGTCAGTC ATGTCAGTCC ATG ATGTCAG ATGTCAGTCCG elektroforeza w żelu poliakrylamidowym

15 Sekwencjonowanie DNA ddATP ddTTP ddCTP ddGTP G A C T 5’ 3’ A T C G

16 Reakcja PCR mieszanina reakcyjna bufor dwuniciowa matryca DNAsekwencja docelowa starter1 starter2 dNTP polimeraza Taq

17 Cykl syntezy DNA w reakcji PCRetap 1 - denaturacja matrycy etap 2 - przyłączenie starterów etap 3 - wydłużanie starterów

18 CYKL 1 denaturacja 94C jednoniciowa matryca DNA

19 przyłączenie startera do matrycy 40-65CCYKL 1 przyłączenie startera do matrycy 40-65C starter 1 starter 2

20 wydłużanie startera 72CCYKL 1 wydłużanie startera 72C starter 1 powstają cząsteczki dłuższe od sekwencji docelowej starter 2

21 denaturacja matrycy 94CCYKL 2 denaturacja matrycy 94C matryca DNA, który powstał w cyklu 1

22 przyłączenie startera do matrycy 40-65CCYKL 2 przyłączenie startera do matrycy 40-65C

23 wydłużanie starterów 72CCYKL 2 wydłużanie starterów 72C powstają cząsteczki dłuższe od sekwencji docelowej powstają cząsteczki o długości sekwencji docelowej

24 Profil termiczny reakcji PCRcykl podstawowy cykle dodatkowe

25 plazmid pUC18/cDNAPPRas2Część praktyczna 0,35 kb B2 B1 0,6 kb A1 A2 mieszanina A: startery A1 i A2 mieszanina B: startery B1 i B2 plazmid pUC18/cDNAPPRas2 ze wstawką 0,8 kp

26 A B 1 - wzorce wielkości 2, 3, 4 - produkty reakcji A, w której jako matrycy użyto lizatu bakterii) 5 - kontrola pozytywna, czyli produkty reakcji A, w której jako matrycy użyto czystego plazmidu 6 - kontrola negatywna, czyli produkty reakcji A, do której nie dodano żadnej matrycy 7 - produkty reakcji B, w której jako matrycy 8 - kontrola pozytywna, czyli produkty reakcji B, 9 - kontrola negatywna, czyli produkty reakcji B, 10 - wzorce wielkości 1,35 kb 1,08 kb 0,87 kb 0,6 kb 0,6 kb 0,35 kb 0,31kb 0,28 kb 0,23 kb 0,19 kb