1 Podstawy terapii genowejWprowadzenie do zagadnień terapii genowej

2 Podstawy terapii genowejWprowadzenie do zagadnień terapii genowej Terapia genowa – jako wprowadzanie prawidłowych genów do komórek w celach terapeutycznych – została zaproponowana przez polskiego uczonego prof. Szybalskiego w latach 60 ub. wieku. Idea została wcielona w życie w 1962r. przez profesora w trakcie eksperymentu na hodowli komórek gdzie zmutowane komórki zostały „uleczone” przez wprowadzenie DNA prawidłowych komórek zawierających prawidłowy gen HPRT – kodujący enzym uczestniczący w metabolizmie puryn. Pierwotnie terapia genowa była skierowana na leczenie chorób dziedzicznych i monogenowych. Coraz częściej jednak próbuje się ją wykorzystać do leczenia innych chorób, w tym nowotworów. Obecnie schematy terapii genowej u ludzi są wciąż udoskonalane. Wiele z nich znajduje się w trakcie badań klinicznych II lub III fazy.

3 Podstawy terapii genowejWprowadzenie do zagadnień terapii genowej Najbardziej skuteczne terapie genowe: Ciężki złożony niedobór odporności (SCID) – pierwsza udana terapia genowa w historii medycyny (1990r.). Obecnie ok. 40 pacjentów przeszło terapię: pobranie komórek macierzystych szpiku, ich transdukcję ex vivo retrowirusem z genem kodującym deaminazę adenozyny, selekcję i proliferację in vitro, przeszczep do pacjenta poddanego supresji komórek szpiku. Choroba Parkinsona – gen dekarboksylazy L-aminokwasów aromatycznych (AADC) zawarty w wektorze AAV (wirus towarzyszący adenowirusom) wprowadzono do mózgu przez kontrolowaną iniekcję stereotaktyczną; 1 pacjent trwale wyleczony Dystrofia mięśniowa Duchenne’a – antysensowny oligomer morfolinowy (Eteplirsen) indukujący przeskok przez ekson 51 w mRNA dystrofiny – powstaje skrócona ale funkcjonalna dystrofina; leczenie 12 chłopców daje efekty kliniczne; prawdopodobna szybka ścieżka rejestracji leczenia Mukowiscydoza – gen transbłonowego regulatora mukowiscydozy w połączeniu z liposomami podawany przez nebulizację; największe badanie kliniczne terapii genowej II fazy – 130 pacjentów; stabilizacja czynności płuc ale brak poprawy w stosunku do wyjściowych parametrów

4 Podstawy terapii genowej STRATEGIE TERAPII GENOWEJ:I Komplementacja defektu genetycznego polega na łagodzeniu skutków biologicznych defektu genetycznego przez wprowadzenie prawidłowego genu (nie usuwa defektu) Przykład: mutacja punktowa w ORF genu β-globiny prowadzi do anemi sierpowatej (zamiana 1 aminokwasu – tetramery α i β-globiny tworzą strąty); wprowadzenie prawidłowego genu β-globiny do komórek macierzystych erytrocytów → wytwarzanie normalnych erytrocytów

5 Podstawy terapii genowejWprowadzanie genów do komórek docelowych: A. in vivo – wprost do organizmu (domięśniowo, doguzowo, systemowo – tj. do krwi) celowane wprowadzanie jest możliwe przez zastosowanie: wektorów wirusowych o określonym tropizmie, nośników (np. liposomy) zawierających odpowiednie ligandy B. ex vivo – poza organizmem; polega na pobraniu komórek (szpik, limfocyty, mioblasty), ich hodowli oraz modyfikacji genetycznej i wprowadzeniu do organizmu

6 Podstawy terapii genowejPowodzenie komplementacji zależy od wielu czynników: dostarczenie genu do określonych komórek np. w leczeniu mukowiscydozy – do komórek nabłonka oddechowego, w nowotworach – do guza ale też do węzłów chłonnych, limfocytów, komórek dendrytycznych gdy suplementacji ulega białko surowicy – dowolna komórka (np. mięśniowa, skóry) może produkować aktywne białko wydzielane do krwiobiegu, np. czynniki krzepnięcia w leczeniu hemofilii 2. przygotowanie konstruktu genowego o dużej i trwałej aktywności (dobór odpowiedniego promotora) 3. wybór komórek o długim czasie życia

7 Podstawy terapii genowej Ograniczenia metody komplementacji:wielkość genu – duże geny trudniej wprowadzić lub nie mieszczą się w wektorach wirusowych wydajność transferu konstruktu genowego do komórek docelowych – wydajność odwrotnie proporcjonalna do wielkości DNA wprowadzenie transgenu, który integruje do genomu gospodarza – może zajść wyciszenie transgenu lub/i insercyjna inaktywacja genu gospodarza okres utrzymywania się efektu – może być nietrwały bezpieczeństwo – wektory adenowirusowe oraz liposomy mogą indukować reakcje zapalne i powstawanie przeciwciał choroby związane z mutacjami dominującymi-negatywnymi – wprowadzenie poprawnego białka nie ma sensu ponieważ obecność zmutowanego białka indukuje zmiany konformacyjne w białku prawidłowym inaktywując je: domena aktywna białko nieaktywne domena nieaktywna

8 Podstawy terapii genowejII Hamowanie ekspresji genu Specyficzne hamowanie ekspresji zmutowanego lub nadmiernie aktywnego genu (wyciszanie na poziomie DNA lub mRNA) protonkogeny – normalne geny odpowiedzialne za regulację podziałów komórkowych, różnicowanie i wzrost (myc, ras, abl) onkogen – powstaje na skutek aktywacji protoonkogenu; bierze udział w promocji nowotworów aktywacja protoonkogenu zachodzi na skutek: transdukcji, mutacji, translokacji, amplifikacji

9 Podstawy terapii genowejHamowanie ekspresji genu przez: 1. oligonukleotydy antysensowne (ASO) – oligonukleotydy liczące około 20 nukleotydów, których sekwencja jest komplementarna do mRNA lub DNA wyciszanego genu; wyciszanie przez: degradację mRNA (aktywacja RNAzyH) steryczną przeszkodę dla aparatu translacyjnego mechanizm epigenetyczny 2. rybozymy – krótkie cząsteczki RNA o właściwościach nukleolitycznych, które wiążą się do określonego fragmentu mRNA i przecinają wiązanie fosfodwuestrowe w specyficzych miejscach

10 Podstawy terapii genowejRybozym o strukturze młotka (hammerhead rybozyme)

11 Podstawy terapii genowej3. interferujący RNA (siRNA, small interfering RNA) – małe cząsteczki dwuniciowego RNA (20-25 nt), które powodują wyciszanie ekspresji genów o homologicznej sekwencji (interferencja RNA, RNAi – RNA interference). Działanie przez: indukcję degradacji mRNA blokowanie translacji

12 Podstawy terapii genowej III Korekta wadliwego genuNaprawa mutacji o charakterze trwałym Wykorzystuje: enzymy naprawiające błędne sparowania (mismatch repair) enzymy wycinające nukleotydy (excision repair) enzymy biorące udział w rekombinacji homologicznej

13 Podstawy terapii genowej IV Celowana eliminacja komórekPrecyzyjne zabijanie komórek zainfekowanych wirusem lub komórek nowotworowych Dla nowotworów: eliminacja bezpośrednia a. wprowadzenie do komórek genu kodującego toksyczne białko (pod kontrolą promotora specyficznego dla nowotworów) b. stosowanie genów samobójczych – przekształcających podawany systemowo prolek do toksycznego leku (np. deaminaza cytozynowa z E. coli przekształca 5-fluorocytozynę do 5-fluorouracylu; kinaza tymidynowa HSV – fosforyluje gancyklowir c. radiouczulanie - deaminaza cytozynowa d. geny proapoptotyczne – indukujące apoptozę (kaspazy, Bax) 2. eliminacja pośrednia a. przez aktywację odpowiedzi immunologicznej b. hamowanie angiogenezy

14 Podstawy terapii genowej V Wprowadzenie dodatkowych genówNadanie komórkom nowej cechy fizjologicznej lub wzmocnienie już cechy posiadanej Przykłady: geny immunomodulacyjne – głównie cytokiny (IL-2, GM-CSF tj. czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów) → nowotwory geny o funkcji ochronnej – podawanie genów oporności wielolekowej (MDR) do szpiku kostnego przed chemoterapią → nowotwory geny antyangiogenne – angiostatyna, endostatyna, tkankowe inhibitory metaloproteaz (TIMP) → nowotwory geny proangiogenne – indukowanie terapeutycznej angiogenezy (naczyniowo śródbłonkowy czynnik wzrostu - VEGF) → miażdżyca, choroba niedokrwienna serca

15 Podstawy terapii genowejOgólna zasada postępowania przy modyfikacjach genetycznych (takich jak np. wprowadzanie dodatkowych genów, hamowanie aktywności genów, naprawa genów)

16 Ogólna zasada postępowania przy modyfikacjach genetycznych – cd.Podstawy terapii genowej Ogólna zasada postępowania przy modyfikacjach genetycznych – cd. 5 6 7 namnażanie bakterii rekombinowanych izolacja plazmidów rekombinowanych wprowadzanie (transfekcja) rekombinowanych plazmidów produkcja rekombinowanych białek/badania podstawowe terapia genowa

17 Metody wprowadzania DNA do komórekPodstawy terapii genowej Metody wprowadzania DNA do komórek Komórki prokariotyczne (E. coli), drożdże: Elektroporacja Generowanie komórek kompetentnych (chemicznie) Transformacja protoplastów Komórki eukariotyczne (ustalone linie komórkowe): metody niewirusowe fizyczne chemiczne metody wirusowe Wprowadzony do komórki gospodarza obcy gen (transgen) może ulec integracji z genomem gospodarza lub pozostać na terenie cytoplazmy jako forma autonomiczna tzw. episom.

18 Podstawy terapii genowejMetody fizyczne Elektroporacja mikroiniekcja Transfekcja przy użyciu ultradźwięków Immunoporacja „Gene gun” (transfekcja balistyczna)

19 Podstawy terapii genowejmikroiniekcja – roztwór DNA wstrzykiwany do pojedynczych komórek pod kontrolą mikroskopu (tworzenie organizmów na poziomie przedzarodkowym)

20 Podstawy terapii genowejelektroporacja – czyste DNA wprowadzane do zawiesiny komórek (komórki krwiotwórcze lub macierzyste) lub in vivo (mięśnie, wątroba, naczynia) – krótki impuls elektryczny wywołuje chwilowe przerwanie ciągłości błony komórkowej

21 Podstawy terapii genowejbalistyczne – drobinki złota lub wolframu pokryte DNA wstrzeliwane do mięśni lub skóry (fala uderzeniowa generowana rozprężającym się gazem lub prochem), stosowane też w hodowlach komórek

22 Podstawy terapii genowejMetody chemiczne Lipofekcja (liposomy) Precypitacja (fosforan wapnia) DEAE – Dekstran (diethylaminoethyl-dekstran) PEI (polietylenoimina) Kompleksy liposomowo-polimerowe (z polilizyną, PEG)

23 Podstawy terapii genowejKompleksy liposomowo-polimerowe dzięki ładunkowi (+) kondensują DNA (-) i wiążą się z zewn. powierzchnią błony komórkowej (-). Wnikają do komórki na zasadzie endocytozy i fuzji błon

24 Podstawy terapii genowejWektory wirusowe Wektory wirusowe to replikacyjnie defektywne wirusy, których wirusowa sekwencja kodująca została całkowicie lub częściowo usunięta na rzecz wprowadzonego transgenu. Wirusy takie mogą transdukować komórki ale nie ulegają w nich namnażaniu i nie powodują lizy komórek. Synteza cząstek wirusa (rekombinowane wirusy) zachodzi tylko w specjalnych liniach komórek eukariotycznych – tzw. liniach pakujących Najczęściej stosowane wirusy: Retrowirusy Adenowirusy AAV (adeno-associated virus) – wirusy tow. adenowirusom

25 Zarejestrowane preparaty terapii genowejPodstawy terapii genowej Zarejestrowane preparaty terapii genowej

26 Podstawy terapii genowejGlybera (gen lipazy lipoproteinowej, LPL, zawarty w wirusie tow. adenowirusom, AAV-1) – pierwszy zarejestrowany (2012; UE) lek terapii genowej: w leczeniu dziedzicznego niedoboru lipazy lipoproteinowej (LPLD) LPL odpowiedzialna za metabolizm tłuszczu: produkowana w mięśniach, adipocytach, sercu, płucach, wątrobie i inn.; przekształca triglicerydy w chylomikronach do wolnych kw. tłuszcz. rzadka choroba (ultra sieroca) : 1-2 przypadki na 1mln objawy – m.in. nawracające zapalenia trzustki Koszt terapii – 1.2 mln £ Leczenie: jednorazowe iniekcje domięśniowe (ok. 60 miejsc w k. dolnych) – efekt ok. 1 rok, stosowanie tylko u chorych z wykrywalnym LPL

27 Podstawy terapii genowejStrimvelis (cDNA deaminazy adenozynowej, ADA, zawarty w retrowirusie) – rejestracja 27 maja 2016 (UE): w leczeniu dziedzicznego złożonego niedoboru odporności SCID-ADA rzadka choroba – 14 przypadków rocznie w Europie transdukcja ex-vivo komórek szpiku kostnego pobranego od pacjenta (CD34+) mieloablacja pozostałego szpiku (chemioterapia) infuzja transdukowanych komórek CD34+ Dotychczasowe dane: 18 dzieci leczonych na przestrzeni 13 lat Wszystkie żyją Wszystkie populacje limfocytów zawierają modyfikację genetyczną Trwale zredukowana zapadalność na infekcje 17 (82%) leczonych nie wymagało dodatkowych interwencji medycznych

28 Podstawy terapii genowejImlygic (T-VEC) – rejestracja 2015 (USA), 2016 (UE): w leczeniu nieoperacyjnego czerniaka modyfikowany onkolityczny wirus HSV-1 atenuowany dodana specyficzność dla komórek nowotworowych dodana sekwencja cDNA GM-CSF (czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów) kilkukrotne iniekcje wirusa do guza przez okres 6-12 mies. Dotychczasowe dane: 430 pacjentów w badaniu III fazy (2:1 grupa kontrolna – GM-CSF) 17% pacjentów – całkowita eliminacja czerniaka mediana przeżycia 2-krotnie większa (41 mies. vs. 21 mies)

29 Podstawy terapii genowejEteplirsen - rejestracja 2016 (USA), leczenie dystrofii mięśniowej Duchenne’a (DMD) antysensowny oligomer morfolinowy indukujący przeskok przez ekson 51 dystrofiny powstaje krótsza ale funkcjonalna dystrofina

30 Podstawy terapii genowejEteplirsen znajdzie zastosowanie w 13% przypadków DMD około 80% mutacji w DMD może się kwalifikować do leczenia przeskokiem przez eksony