1 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  POLITÉCNI CO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE Introdução ao Diagnóstico Molecular Rúben Fernandes, PhD Prof. Adjunto, com Agregação [email protected]

2 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Docente Ruben Fernandes Prof. Adjunto com Agregação (Biomedicina, FMUP) [email protected] I3S – Metabolismo, Nutrição e Endocrinologia, U.Porto 1

3 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Programa 1-O diagnóstico molecular 2-Biomarcadores 3-Técnicas de diagnóstico molecular 4-Fluorescência 5-Citogenética clássica e molecular 6-Diagnóstico molecular de doenças infecciosas 2

4 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  3

5 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Diagnóstico molecular em medicina  O diagnóstico químico e molecular desempenha hoje um papel fundamental em medicina.  Pode-se assumir que os dados obtidos dos laboratórios clínicos contribuem para cerca de 50 a 80% do diagnóstico médico.  Além dos métodos clássicos de diagnóstico em bioquímica clínica (ensaios enzimáticos, fotometria, electroquímica, espectrometria de absoração atómica, métodos colorimétricos, …) os métodos imunológicos e genéticos ganharam uma importância nas últimas décadas. 4

6 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Diagnóstico molecular em medicina  A tecnologia de análise de ácidos nucleicos também tem contribuído para o desenvolvimento do diagnóstico molecular  Tem-se verificado ainda, um aumento crescente do nosso conhecimento acerca das doenças genética e dos princípios moleculares da doença  O termo diagnóstico molecular pode ser usado em várias situações 5

7 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Diagnóstico molecular em medicina  Definição sensu latu: Utilização de métodos analíticos que são usados em laboratórios clínicos para determinar, em amostras de pacientes, a presença de moléculas ou da sua função.  Definição sensu strictum: O termo diagnóstico molecular pode ser usado como abreviatura de diagnóstico genético molecular. E pode ser usado para a determinação das alterações no material genético (sequenciação), interpretação da sua informação (expressão genética) ao nível molecular (DNA ou mRNA). 6

8 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Diagnóstico molecular em medicina  Importância/utilidade - doenças genéticas - doenças infecciosas (virologia e bacteriologia)  Devido à grande sensibilidade e especificidade das técnicas e rapidez de detecção 7

9 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Doenças monogénicas e poligénicas  Doenças monogénicas mutação ou perda de função de um único gene padrão de hereditariedade (recessivo / dominante)  Doenças poligénicas múltiplas modificações genéticas maior frequência em algumas famílias mas sem um padrão de herança genética típico/reconhecível 8

10 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Doenças monogénicas  Um exemplo típico de doença monogénica recessiva: Fibrose quística – 1:600 – perda de função do canal Cl - Gene CFTR (cystic fibrosis transmembrance conductance regulator) -Para cada célula diploide, a alteração só se manifesta se ocorrer a perda da função do gene em ambos cromossomas homólogos; -No entanto podem ocorrer heterozigóticos para o gene defeituoso – mas uma quantidade de suficiente de proteína funcional é produzida 9

11 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Fibrose quística 10 Cl - ATP AMPc Cl - ATP AMPc

12 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  11

13 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Fibrose quística  Estatisticamente, ¼ da descendência de portadores desta condição será afectada (homozigóticos) para o gene com perda de função  Dadas as suas características, diagnóstico da FQ é obtido apenas por genética molecular  No entanto, apenas algumas mutações causam mais de 80% de perda de função da proteína  Existem ainda muitas mutações que causam proteínas imperfeitas  O diagnóstico é muito complexo 12

14 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Doenças monogénicas  As doenças dominantes (um único alelo é suficiente para desencadear a doença) são ainda mais raras que as recessivas  São geralmente causadas por novas mutações  A doença genética dominante mais frequente é talvez a cardiomiopatia hipertrófica (CMH) que é causada por mutações em diferentes proteína do músculo cardíaco.  As proteínas mais frequentemente afectadas são as proteínas do sarcómero, como por exemplo a β-miosina. 13

15 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  14

16 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  15 GeneName MYH7ß - Myosin heavy chain MYBPC3Cardiac myosin-binding protein C TNNT2Cardiac troponin T TNNI3Cardiac troponin I TPM1Tropomyosin 1 α ACTCα Cardiac actin 1 MYL3Essential myosin light chain 3 MYL2Regulatory myosin light chain 2 LAMP2Lysosome-associated membrane protein 2 PRKAG2Noncatalytic AMP-activated protein kinase gamma 2 GLAGalactosidase alpha (Fabry) CAV3Caveolin 3 (Muscular dystrophy) MTTGMitochondrial transfer RNA glycine MTTIMitochondrial transfer RNA isoleucine MTTKMitochondrial transfer RNA lysine TTRTransthyretin (Amyloidosis) TNNC1Troponin C

17 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Cardiomiopatia hipertrófica  Uma das complicações frequentes é a fibrilação ventricular, que conduz à morte cardíaca e afecta sobretudo homens saudáveis e desportistas.  Ataca sobretudo homens de meia idade o risco de morte aumenta com a idade devido ao aumento da insuficiência cardíaca;  Conhecem-se centenas de mutações que poderão causar CMH mas nenhuma delas é relativamente frequente (?) 16

18 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Doenças poligénicas  Causadas pela interacção de diferentes mutações em diferentes genes;  Individualmente as mutações não apresentam grandes efeitos, mas em conjunto podem ter consequências catastróficas;  Os diferentes genes ou alelos associados à doença referem-se como factores de risco; 17

19 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Doenças poligénicas  Ex: enfarte do miocárdio:  Um dos principais factores de risco é a hipercolesterolémia familiar  mutações a) receptor da LDL (LDLR) b) ou no seu ligando a ApoB100 forma mais suave de hipercolesterolémia c) polimorfismos e mutações da ApoE 18

20 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  POLITÉCNI CO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE Variabilidade individual 19

21 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Variabilidade individual / diagnóstico molecular -Biologia forense -Tipagem HLA -Farmacogenómica -Susceptibilidade a doenças infecciosas -Virologia / bacteriologia / … -Epidemiologia/filogenia molecular -Resistências 20

22 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  1. Biologia Forense  Base de dados de DNA do FBI: CODIS  Combined DNA Index System  Lançado em 1998  Utilizado para resolver crimes em série  Requer:  >4 marcadores RFLP  e/ou13 marcadores STR 21

23 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Biologia Forense  Base de dados de DNA do FBI: CODIS  STRs – short tandem repeats  AATG  Homozigóticos se ambos os alelos tiverem o mesmo tamanho  Heterozigóticos se os alelos tiverem tamanhos diferentes 22

24 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  23 Cuidado ! Primers diferentes produzem produtos de PCR (amplicões) de diferentes tamanhos para o mesmo alelo STR 195 bp / GTAA 170 bp / TCAT

25 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  2 indivíduos diferentes 24 amelogenin D19 D3 D8 TH01 VWA D21 FGA D16 D18 D2 amelogenin D19 D8 TH01 VWA D21 FGA D16 D18 D2 D3 Identificação humana com um kit de multiplex STR Análise simultânea de 10 STRs e identificação sexual (AmpFlSTR® SGM Plus™ kit) probabilidade de correspondência ao acaso: ~1 em 3 trilhões Tempo de todo o processo de identificação: 5 horas

26 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  2. Tipagem HLA  Sistema antigénio leucocitário humano (#6)  A espécie humana exibe um grande polimorfismo no gene HLA e os seus produtos (MHC I e MHC II) apresentam os antigénios às células T.  O sistema HLA contribui para a rejeição dos órgãos transplantados. 25

27 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Tipagem HLA  Um transplante só é levado a cabo se houver compatibilidade do sistema HLA. A tipagem do sistema HLA pode ser feito por FACS ou por geno- tipagem.  FACS – Fluorescence activated cell sorting 26

28 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Tipagem HLA  Genotipagem do sistema HLA: 27

29 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  28 1-Obtenção do sangue periférico 3-Amplificação dos alelos HLA2-Extracção de mRNA 4-Marcação fluorescente dos produtos amplificados 5-Hibridação num microarray 6-Análise dos resultados e consulta de base de dados

30 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Tipagem HLA  Tipagem celular do sistema HLA 29

31 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  30 1-Obtenção do sangue periférico 2-Extracção dos leucócitos 3-Reacção imunológica in vitro com atc marcados com fluorescência 4-Leitura no citómetro de fluxo 5-Interpretação dos histogramas

32 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  3. Farmacogenómica  Farmacogenética vs. Farmacogenómica É um campo da Farmacologia clínica Estuda a influência de factores genéticos na resposta à administração de fármacos Para cada gene isoladamente, interpretando os resultados experimentais 31

33 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  3. Farmacogenómica  Farmacogenética vs. Farmacogenómica É o estudo de conjuntos “completos” de genes com relevância farmacológica De como evidenciam as suas variações De como essas variações interagem para produzir diferentes fenótipos De como esses fenótipos afectam a resposta à administração de fármacos 32

34 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]   100 mil pacientes morrem anualmente nos EUA devido a efeitos tóxicos ou secundários da administração de fármacos. Uma das principais razões está no polimorfismo genético.  Amalia M. Issa, Nature Reviews, 2002, 1, 300-308 Pharmacogenomics, 2004, 5, 571- 579 33

35 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]   Amalia M. Issa, Nature Reviews, 2002, 1, 300-308 Pharmacogenomics, 2004, 5, 571-579 34

36 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Farmacogenómica  Poucos são os sistemas enzimáticos que estão envolvidos no metabolismo de fármacos, como é o exemplo das oxidases do citocromo P450.  O complexo Citocromo oxidase P450 é extremamente polimórfico e é o responsável pela grande variabilidade individual ao metabolismo de um grande número de fármacos.  Actualmente, uma pequena quantidade de DNA pode ser usada para genotipar polimorfismos do CYP450 35

37 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Farmacogenómica  Genotipagem dos polimorfismos da citocromo oxidase P450  (Roche-AmpliChip®) 36

38 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  37

39 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  4. Susceptibilidade a doenças infecciosas  A variabilidade individual também se apresenta bastante importante na questão da sensibilidade a doenças infecciosas.  Muitos microrganismos reconhecem receptores celulares específicos do hospedeiro como “portas” de entrada neste. Muitos agentes patogénicos usam ainda os sistemas celulares do hospedeiro para sua replicação e secreção.  Tanto os receptores celulares como os marcadores de susceptibilidade intracelular podem ser analisados ao nível genómico. 38

40 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Susceptibilidade a doenças infecciosas  4.1. Susceptibilidade genética  A síndrome da imunodeficiência grave combinada (SCID) é uma doença que está presente à nascença e deve-se à deficiência em ADA (Adenosina desaminase)  Maior susceptibilidade às infecções 39

41 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  SCID: diagnóstico Imunológico (Citometria de fluxo, ELISA, RIA, Western): - Função imunológica do sangue - Níveis de células B e T - Níveis de IgG, IgA, IgM Bioquímico -Actividade da enzima Efectuam-se ensaios in vitro em culturas celulares e os metabolitos são analisados por electroforese capilar (ou HPLC, TLC bidimensional) 40

42 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Terapêutica da SCID  Terapia genética/celular 41

43 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Terapêutica da SCID 42

44 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Susceptibilidade a doenças infecciosas  4.2. Resistência genética  A síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) em alguns indivíduos pode ser mais dificilmente adquirida devido à mutação num gene de um receptor celular (CCR5), denominada de ∆ 32  Menor susceptibilidade ao HIV 43 HIV-1 interacts with a cell-surface receptor, primarily CD4, and through conformational changes becomes more closely associated with the cell through interactions with other cell-surface molecules, such as the chemokine receptors CXCR4 and CCR5.

45 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Diagnóstico da “resistência” ao HIV 44  Gene CKR-5 wildtype responsável pelo fenótipo normal da CCR5 a o gene mutado EU CKR-5 responsável pelo fenótipo de susceptibilidade reduzida ao HIV.  Homozygous Defect in HIV-1 Coreceptor Accounts for Resistance of Some Multiply-Exposed  Individuals to HIV-1 Infection Liu et al. (1996). Cell, 86, 367–377,.

46 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]   A detecção da delecção 32 do gene receptor CCR5 (CKR5) faz-se mediante PCR convencional: 45 Electroforese de produtos amplificados por PCR. 1 – marcador; 2 – indivíduo homozigótico para o CKR5-WT; 3 e 5 – homozigóticos para a mutação (EU CKR5); 4 e 6 – heterozigóticos (CKR5- WT/EU CKR5). Homozygous Defect in HIV-1 Coreceptor Accounts for Resistance of Some Multiply-Exposed Individuals to HIV-1 Infection Liu et al. (1996). Cell, 86, 367–377.

47 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  5. Diagnóstico molecular de agentes infecciosos  O diagnóstico molecular de agentes infecciosos (vírus, bactérias, leveduras e fungos filamentosos, microparasitas) tem vindo a ganhar terreno relativamente aos métodos microbiológicos convencionais (culturais, bioquímicos, imunológicos, celulares, …) 46

48 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  HIV  Diagnóstico:  Imunológico (Western-blotting, ELISA) 47

49 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  HIV  Diagnóstico:  Imunológico (Western-blotting, ELISA) 48

50 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  HIV  Diagnóstico:  Genético (RT-PCR) Além do diagnóstico – carga viral 49

51 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  6. Epidemiologia molecular/filogenia molecular  A identificação de surtos infecciosos tem utilizado importantes ferramentas da filogenia e da biologia molecular:  Importância: -Doenças infecciosas de origem hospitalar/comunitário -Doenças infecciosas de origem alimentar  Técnicas de genotipagem (molecular fingerprinting) 50

52 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Epidemiologia molecular 51 Afectado Não afectado ?

53 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Epidemiologia molecular 52 Afectado Não afectado

54 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Epidemiologia molecular 53 Afectado Não afectado A mesma estirpe?

55 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Epidemiologia molecular  Existem vários métodos de fingerprinting molecular 54 MEE - multilocus enzyme electrophoresis; REA – restriction enzyme analysis; PFGE - pulsed field gel electrophoresis; RAPD – random amplified polymorphic DNA; AFLP – amplified fragment length polymorphism; MLST – multiple locus sequence subtyping; MLVA - multiple locus variable number of tandem repeat analysis; MBMS –microarray-based multi-target sequencing

56 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Epidemiologia molecular 55 Enterobacterial repetitive intragenic consensus (ERIC) fingerprinting profiles of multidrug-resistant (MDR) Escherichia coli (A) and Klebsiella pneumoniae (B) isolated from bloodstream-infected patients from two distinct Portuguese hospitals A and B. Dendrograms were generated by UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic averages) analysis of the agarose gels contrastained by rainbow algorithm with Pearson’s correlation coefficient. Bloodstream infections caused by multidrug-resistant Enterobacteriaceae: report from two different Portuguese hospitals. Fernandes et al. (2008). J Hospital Infection, 70(1):93-5.

57 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  7. Resistência aos xenobióticos  As estirpes bacterianas possuem uma genética que lhes permite a rápida aquisição de genes de resistência a poluentes ambientais, metais pesados, antibióticos entre outros. 56

58 POLITÉCNICO DO PORTO ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE  Rúben Fernandes, PhD  [email protected]  Genética molecular da resistência  Mutações espontâneas em genes endógenos  Genes estruturais: aumento do espectro da actividade enzimática, modificação do alvo, defeitos no transporte  Genes reguladores: aumento da expressão  Aquisição de genes exógenos:  Geralemente genes que codificam enzimas inactivadoras ou alvos modificados e genes reguladores  Mecanismos de transferência de DNA: conjugação (contacto célula-célula); transformação (uptake do DNA em solução); transdução (transferência de DNA por bacteriófagos)  Expressão dos genes de resistência  Indução reversível/os sistemas de repressão podem afectar os fenótipos de resistência 57