1 PRÁCTICO N° 6 Interacciones microorganismos - plantaObjetivo: Conocer las técnicas de laboratorio para el manejo de microorganismos que interactúan con las plantas Interacciones más comunes Positivas (sinérgicas) Simbiosis (micorrizas, rizobios) Mutualismo (Azozpirillum) Negativas (antagónicas) Competencia Amensalismo Aislamiento de microorganismos Selección de cepas Producción de inoculantes Técnicas de laboratorio
2 Simbiosis: micorrizasEctomicorrizas Endomicorrizas Intercelulares Manto externo Raíz modificada Hongos superiores Cultivables Intercelulares e intracelulares Sin manto externo Sin raíz modificada Hongos inferiores No cultivables Actividad: observar micorrizas en raíces de pino
3 Aislamiento de microorganismos: rizobiosincubar estriar en medio YEM cortar la raíz lavar seleccionar nódulos turgentes extraer los nódulos desinfectar con H2O2 (5minutos) macerar enjuagar con H2O estéril 1 mL de H2O estéril repicar (pico de flauta) colorear (Gram -) conservar
4 Aislamiento de microorganismos: rizobiosExtraer los nódulos Raíz de leguminosa Enjuagar con H2O estéril Desinfectar con H2O2 (20%) 5 minutos
5 Aislamiento de microorganismos (rizobios)Colocar los nódulos en un tubo con 1ml de agua estéril Macerar con varilla de vidrio Incubar (28-30° C) Estriar en medio YEM Extraer una alícuota
6 Aislamiento de microorganismos (rizobios)Colorear y observar Cultivo de rizobio Incubar y conservar Repicar a “pico de flauta”
7 Actividades: - realizar macerado de nódulos y colorear - observar al microscopio bacteroides y bacterias . Nodulos (A a C) y bacteroides (D a F) deP. sativum cv. (arveja).
8 Síntesis de aislamiento de rizobiosincubar estriar en medio YEM cortar la raíz lavar seleccionar nódulos turgentes extraer los nódulos desinfectar con H2O2 (5minutos) macerar enjuagar con H2O estéril 1 mL de H2O estéril repicar (pico de flauta) colorear (Gram -) conservar
9 Aislamiento de microorganismos: Azospirillumincubar cortar raíz lavar 1 g de raíz colocar en H2O estéril y agitar extraer alícuota sembrar en medio NFB semisólido crecimiento de Azospirillum aislamiento en medio NFB sólido repicar (pico de flauta) colorear (Gram -) conservar
10 Suspender en H2O estérilAislamiento de microorganismos: Azospirillum Gramínea Cortar raíces Suspender en H2O estéril Extraer alícuota Agitar
11 Aislamiento de microorganismos: AzospirillumIncubar Sembrar en medio NFB semisólido Halo de crecimiento de Azospirillum Repicar a “pico de flauta" Incubar y conservar
12 Síntesis de aislamiento de Azozpirillumincubar cortar raíz lavar 1 g de raíz colocar en H2O estéril y agitar extraer alícuota sembrar en medio NFB semisólido crecimiento de Azospirillum aislamiento en medio NFB sólido repicar (pico de flauta) colorear (Gram -) conservar
13 Selección de cepas para capacidad fijadora de NEnsayo de laboratorio: alfalfa Medio de cultivo: Yensen Testigo: medio sin N sin inocular Control: medio sin N inoculado con cepa eficiente Tratamientos: medio sin N inoculados con cepas a testear Testigo: medio con N sin inocular
14 Síntesis de selección de cepasTestigo medio sin N sin inocular Control inoculado con cepa eficiente Tratamientos inoculados con cepas a testear medio con N
15 Selección de cepas: parámetros de evaluaciónCantidad de nódulos Color Posición en la raíz Actividad Nasa N en planta Peso de raíz
16 Síntesis de producción de inoculanteincubar (4-5 días) filtro de aire manguera aireador cámara de aire 30% incubar 3 o 4 días extraer una alícuota de cultivo conservado cultivar en medio YEM liquido (pie de cuba) colorear (control del pie de cuba) agregar antibiótico colocar el pie de cuba (control del inoculante) Primera etapa cultivo de iniciación (pie de cuba) Segunda etapa cultivo a gran escala (biodigestor) 50 ml Medio Ashby (estéril)
17 Producción de inoculantesMangueras Tapones Biodigestores Filtro de aire Mechero Aireador
18 Producción de inoculantesPlanta Industrial Actividad: observar un biodigestor