1 PRINCIPIS DE BIOQUÍMICA I BIOLOGIA MOLECULAR Dr. Joan Bertran. Dept. Bioquimica i Biologia Molecular. UB Objectiu: unificar conceptes. PROGRAMA: 1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector. 2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses). 3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS. 4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, panning...). 5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica. 6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors. 7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica. BIBLIOGRAFIA Introduction to Genetic Analysis. 7th ed. Griffiths, Anthony J.F.; Miller, Jeffrey H.; Suzuki, David T.; Lewontin, Richard C.; Gelbart, William M. New York: WH Freeman and Co; c1999. Molecular Cell Biology. 4th ed. Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell, James E. New York: WH Freeman and Co; c1999. Genomes. 2nd ed. Brown, T. A. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers, Ltd 2002. Human Molecular Genetics 2. 2nd ed. Strachan, Tom and Read, Andrew P. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers Ltd; 1999. Ingeniería Genética y transferencia Génica. Marta Izquierdo Rojo; Editorial Pirámide Madrid, 2001

2 PROGRAMA: 1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector. 2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses). 3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS. 4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, panning...). 5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica. 6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors. 7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

3

4 PROGRAMA: 1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector. 2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses). 3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS. 4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, panning...). 5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica. 6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors. 7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

5

6

7

8

9 PROGRAMA: 1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector. 2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses). 3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS. 4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, panning...). 5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica. 6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors. 7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22 CRE-RECOMBINASE ataacttcgtata gcatacat tatacgaagttat loxP Cre recombinase loxP A B Excision of a loxP flanked region

23 Cloning vectorSize of insert Standard high copy number plasmid0 - 10 kb Bacteriophage insertion 0 - 10 kb Bacteriophage replacement 9 - 23 kb Cosmid30 - 44 kb PAC (P1 artificial chromosome)130 - 150 kb BAC (bacterial artificial chromosome)up to 300 kb YAC (yeast artificial chromosome)0.2 - 2.0 Mb

24 PROGRAMA: 1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector. 2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses). 3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS. 4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, panning...). 5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica. 6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors. 7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37 PROGRAMA: 1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector. 2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses). 3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS. 4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, panning...). 5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica. 6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors. 7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

38

39

40

41

42

43

44

45 PROGRAMA: 1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector. 2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses). 3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS. 4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, panning...). 5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica. 6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors. 7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

46 RECOMBINACIÓN IN VIVO

47 gene of interest selection marker targeting construct XX homology double homologous recombination selection marker inactivated gene HOMOLOGOUS RECOMBINATION

48

49

50 egg sperm fertilized egg ZYGOTE 32-64-cell stage BLASTOCYST inner cell mass (ICM) Embryonic Stem cells: culture genetic manipulation reintroduce in host-embryo

51

52

53 CRE-LOXP: TISSUE-SPECIFIC GENE INACTIVATION (only one floxed allele indicated, should be homozygous or other allele otherwise inactivated)

54

55

56 PROGRAMA: 1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector. 2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d’àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses). 3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS. 4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cDNA, marcatge d’àcids nucleics, hibridació d’àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, panning...). 5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica. 6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors. 7) Expressió de gens clonats: caset d’expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

57

58

59 cDNA Affinity tag T7 promoter Insert in an expression plasmid TAA ATG NH 4 Purify fusion protein via affinity tag Common affinty tags are be 6X-His & GST – both protein will bind reversibly with high affinty and specificty to a particular chromatography resin Needs to be in frame

60

61 Liposome Electroporation Transfection

62

63

64

65

66 HEMOFÍLIA B RECESSIVA, LLIGADA AL CROMOSOMA X MANCA FACTOR IX SÍNTESI AL FETGE ALLIBERACIÓ AL TORRENT ON PARTICIPA EN LA COAGULACIÓ TRACTAMENT TRANSFUSIONS: RISC DE INFECCIONS VÍRIQUES (HB, HIV) FACTOR IX RECOMBINANT VIDA MITJA CURTA CARÍSSIM HI HA MODELS ANIMALS; FACILITEN EL DESENVOLUPAMENT DE NOVES TERÀPIES

67 Blood, 15 April 2002, Vol. 99, No. 8, pp. 2670-2676 Sustained phenotypic correction of hemophilia B dogs with a factor IX null mutation by liver-directed gene therapy Jane D. Mount, Roland W. Herzog, D. Michael Tillson, Susan A. Goodman, Nancy Robinson, Mark L. McCleland, Dwight Bellinger, Timothy C. Nichols, Valder R. Arruda, Clinton D. Lothrop Jr, and Katherine A. High From the Scott-Ritchey Research Center and Department of Clinical Sciences. College of Veterinary Sciences, Auburn University, AL; Departments of Pediatrics and Pathology, University of Pennsylvania Medical Center and The Children's Hospital of Philadelphia; and Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of North Carolina, Chapel Hill.

68 Therapeutic factor VIII levels and negligible toxicity in mouse and dog models of hemophilia A following gene therapy with high-capacity adenoviral vectors M. K. L. Chuah, G. Schiedner, L. Thorrez, B. Brown, M. Johnston, V. Gillijns, S. Hertel, N. Van Rooijen, D. Lillicrap, D. Collen, T. VandenDriessche, and S. Kochanek Blood, March 1, 2003; 101(5): 1734 - 1743. AAV-mediated factor IX gene transfer to skeletal muscle in patients with severe hemophilia B C. S. Manno, A. J. Chew, S. Hutchison, P. J. Larson, R. W. Herzog, V. R. Arruda, S. J. Tai, M. V. Ragni, A. Thompson, M. Ozelo, L. B. Couto, D. G. B. Leonard, F. A. Johnson, A. McClelland, C. Scallan, E. Skarsgard, A. W. Flake, M. A. Kay, K. A. High, and B. Glader Blood, April 15, 2003; 101(8): 2963 – 2972 (administration of AAV vector by the intramuscular route is safe at the doses tested and effects gene transfer and expression in humans in a manner similar to that seen in animals)