1 Produkcja ludzkich rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych metodą ekspresji fagowej
2 Wyodrębnianie pozytywnych klonówImmunizacja Komórki śledziony Komórki szpiczaka Fuzja Komórki hybrydomy Test na przeciwciała Wyodrębnianie pozytywnych klonów Subklonowanie Produkcja przeciwciał in vivo Produkcja przeciwciał in vitro Zamrażanie komórek hybrydomy Przeciwciała monoklonalne
3 Produkcja przeciwciał monoklonalnych metodą PHAGE DISPLAY
4 ADAM17
5 Stworzenie i wyselekcjonowanie aptameruRNA (lub DNA)Cel projektu: Stworzenie specyficznego inhibitotra hamującego aktywność proteolityczną sekretazy ADAM17 Stworzenie i wyselekcjonowanie aptameruRNA (lub DNA) stworzenie i wyselekcjonowanie fragmentu przeciwciała scFV (ang. single chain variable fragment) metodą ekspresji fagowej
6 Co to takiego rekombinowane przeciwciało w formacie scFV?Fab Fv Fc Linker Budowa przeciwciała rekombinowanego scFV Budowa przeciwciała
7 Fagemidowa biblioteka ludzkich rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych Tomlinson I+Jwektor fagemidowy pIT2 M13 ori colE1 ori amp lac promoter scFV myc pIII
8 Tomlinson I+J : rozmiar bibliotekiI x J x10 8
9 Budowa faga filamentarnego
10 Bakterie - biblioteka fagemidówJak to działa? fagemid H L + Fag pomocniczy KM13 ssDNA Bakterie - biblioteka fagemidów Infekcja Ampicylina fagemid H L białko pIII Kanamycyna Fagi potomne wykorzystywane do selekcji białko pIII-scFV
11 Immunoselekcja - wyszukiwanie fagów wiążących antygenFagi specyficznie wiążące antygen Fagi negatywne Fagi negatywne Fagi specyficznie wiążące antygen
12 Mianowanie i amplifikacja pozytywnych fagówFagi specyficznie wiążące antygen Elucja przy pomocy trypsyny Fagi poliklonalne Mianowanie i amplifikacja pozytywnych fagów
13 Proteoliza białka pIII przez trypsynęfagemid H L Trypsyna Fagi puste są nieinfekcyjne Fagi z scFv po działaniu trypsyny mogą infekować bakterie fagemid H L
14 Jak mianuje się pozytywne fagi?Fagi wiążące antygen Bakterie TG1 Tr + Infekcja Podłoże z ampicyliną Liczymy kolonie bakterii
15 Jak amlifikuje się pozytywne fagi?Fagi wiążące antygen Bakterie TG1 Tr + Infekcja Pożywka z ampicyliną Bakterie TG1 Tr z fagemidami kodującymi scFv wiążące antygen phage(mid) H L
16 I znów fag pomocniczy............ + Infekcjaphage(mid) H L + Fag pomocniczy KM13 Bakterie TG1 Tr z fagemidami kodującymi scFv wiążące antygen Infekcja phage(mid) H L Fagi potomne wiążące antygen Kolejna runda immunoselekcji na antygenie
17 Miano fagów po poszczególnych rundach immunoselekcji na metADAM17 [cfu/ml]Biblioteka I: Biblioteka J Runda I x x105 RundaII x x 107 RundaIII x x 1010
18 Testowanie wyodrębnionych fagów poliklonalnychMiano fagów po poszczególnych rundach immunoselekcji na metADAM17 [cfu/ml] Przeciwciała rozpoznające faga KM13 Biblioteka I: Biblioteka J Runda I x x105 RundaII x x 107 RundaIII x x 1010 HRP HRP Fagi specyficznie wiążące antygen
19 Poliklonalnay fagowy test ELISA anty-metADAM17Biblioteka I Biblioteka J Runda I II III I II III
20 Jak z populacji poliklonalnych fagów wiążących metADAM17 wyodrębnić fagi monoklonalne?Hodowla poszczególnych kolonii na płytce 96-studniowej Szalki z bakteriami po mianowaniu 2 Infekcja bakterii Fagiem KM13 3 Monoklonalne fagi potomne analizowane testem ELISA
21 Monoklonalny fagowy test ELISA anty ADAM17II III
22 Ale jak otrzymać rozpuszczalne scFV?
23 Infekcja bakterii HB2515 monoklonalnymi fagami anty metADAM17 pozwala na produkcję rozpuszczalnych scFV
24 Immunoselekcja na komórkachBiotynylacja ADAM17 + ADAM17 - Streptawidyna z kuleczkami magnetycznymi m m Fagi m m m m Elucja fagów które związały się tylko do komórek ADAM+ Rozdzielenie komórek na seperatorze magnetycznym
25 Oczyszczanie scFV Chromatografia powinowactwa z wykorzystaniem białek bakteryjnych A oraz L. Chromatografia powinowactwa na złożach z jonami niklu lub wolframu. Chromatografia powinowactwa z wykorzystaniem przeciwciał wiażących metkę c-myc.