1 PROGRAMAS DE CRIBADO NEONATAL Fundación Sira CarrascoEncuentros 2006 Fundación Sira Carrasco Dra. Teresa Casals

2 Marcadores TIR1 cut-off buena sensibilidadESCRIBA CON LAPIZ NOMBRE Y APELLIDOS Marcadores TIR1 cut-off buena sensibilidad reducir detección de portadores DNA aumenta sensibilidad ≥ 80% TIR2 aumenta especificidad PAP reduce tiempo vs DNA neonatos para estudio genético ~ 0,5%

3 Estrategias en los PCN TIR1 TIR1 / TIR2 / T. de sudorTIR1 / F508del / TIR2 TIR1 / DNA / T. sudor TIR1 / DNA (3 mutac.) / T. sudor (Suecia) TIR1 / DNA (20 mutac.) / TIR2 / T. sudor (Francia) TIR1 / TIR2 / DNA / T. de sudor

4 RESUMEN Castilla y León TIR / DNA / U 1/ 4.083Cataluña TIR1 / TIR2 / DNA / U 1/ 5.457 Baleares TIR1 / DNA / U 1/ 4.433 Galicia TIR1 / TIR2 / DNA / U 1/ Extremadura TIR1 / TIR2 / DNA / U Aragón TIR1 / DNA / TIR2, U Madrid TIR / DNA vs TIR / PAP Murcia TIR1 / TIR2 / DNA / U

5 PROGRAMA DE CRIBADO NEONATAL EN CASTILLA Y LEÓNJuan José Tellería

6 Muestra de sangre en papel de filtroNivel de T.I.R. < 70 ng/ml >70ng/ml 0,9% negativo positivo Estudio secuencial de mutaciones CFTR (> 80% de alelos)

7 Estudio secuencial de mutaciones CFTR (> 80% de alelos)Estudio % acumulado F508del 61,10 MultiA (11,14b,17b) 73,58 Exón ,44 Exón ,09 Exón ,74 Capacidad de detección de mutaciones en enfermos FQ Ambos alelos 70,12% Un alelo 27,24% Ningún alelo ,64%

8 Estudio secuencial de mutaciones CFTR (> 80% de alelos) 2 mutacs. 1 mutac. No mutac. positivo diagnóstico negativo 92,1% de positivos a TIR confirmación Test del sudor Test del sudor positivo negativo -Consejo genético y estudio de los padres. -Seguimiento??? 2,6% de positivos a TIR

9 * De las muestras IRT>70 ng/ml Muestras estudiadas : IRT>70 ng/mL (0,95%) Enfermos FQ 31 (1/4.083) Portadores 64 (1/18,9%)* * De las muestras IRT>70 ng/ml

10 5 NO F508del EN NINGÚN ALELO (17%)Enfermos Mutaciones 10 F508del HOMOCIGOTOS (33%) 16* F508del + OTRAS (50%) 5 NO F508del EN NINGÚN ALELO (17%) Frecuencia alélica de F508del* 58,3% * 2 de ellos fueron gemelos monocigotos. Para calcular las frecuencias alélicas se consideraron como un solo caso

11 PROGRAMA DE CRIBADO NEONATAL EN CATALUÑAAntoni Maya

12 MARCADORES MÁS UTILIZADOS EN LA DETECCIÓN NEONATAL DE F.Q.Estudio de la TIR (bioquímico) TIR Estudio del DNA (mutacional) DNA Estudio combinado (TIR+DNA) + TIR DNA Programa de Cataluña TIR DNA

13 PROTOCOLO DE CRIBADO NEONATAL DE LA FIBROSIS QUÍSTICA EN CATALUÑAU. Cribado 1 U. Genética 1 U. Clínicas 3 Centros maternales 71 CRIBADO NEONATAL F.Q. (2-5 días) TIR-1 SIN TIR-1 TIR-1 < 120 NG/ML TIR-1 > 120 NG/ML (25-40 días) TIR-2 PETICIÓN 2ª MUESTRA SIN TIR-2 TIR-2 < 60 NG/ML TIR-2 > 60 NG/ML DETECCIÓN (-) DETECCIÓN (+) SIN 1-2 TIR NO PROTOCOLO PROTOCOLO 31 MUTACIONES CFTR TEST DEL SUDOR NO MUTACIÓN 1 MUTACIÓN 2 MUTACIONES Cl < 60 meq/L Cl > 60 meq/L DETECCIÓN (-) FENOTIPO FQ ESTUDIO DEL GEN CFTR NO MUTACIÓN 1 MUTACIÓN 2 MUTACIONES

14 CASOS FUERA DE PROTOCOLO CAUSAS QUE INVALIDAN LA DETERMINACIÓN DE TIRSin TIR1 Sin TIR2 Muestra < 48 horas 31 Muestra insuficiente 25 Pretérmino 13 Transfusión 13 Íleo meconial 8 Sin muestra 8 Muestra > 40 días Sin muestra Antecedentes familiares 5 Ingreso hospitalario 3 Íleo meconial n = 290 n = 98

15 RESULTADOS DEL CRIBADO NEONATAL DE FIBROSIS QUÍSTICA EN CATALUÑARecién nacidos analizados hasta 31/12/2005 = Período evaluado : 09/1999 a 12/2004 Recién nacidos analizados Positivos TIR-1 Estudios genéticos realizados • Por protocolo TIR-1 y 2 (+) • Por fuera de protocolo Nº recién nacidos con mutación CF confirmadas Número casos 5.402 1.718 1.468 250 166 68 % sobre la muestra 100,00 1,45 0,46 0,39 0,06 0,044 0,018 Frecuencia 1/2.236 1/5.457

16 ESTUDIO GENÉTICO A) PCR / OLA 31 mutaciones B) Análisis completo gen CFTR Muestras CF / CF CF / - 1.718 33 133 FQ Portador 29 CF / CF 3 CF / - 70 CF/variante 31

17 ESTUDIO CLÍNICO EN LOS CASOS DIAGNOSTICADOS DE FQ. (n=68) Septiembre 1999-Diciembre 2004 TEST DEL SUDOR MANIFESTACIONES CLÍNICAS Íleo meconial Insuf. pancreática Cultivo + (Ps. y St.) Asintomáticos % Casos Genotipo T. sudor + T. sudor - CF/CF 33 - CF/- 32 101

18 DIAGNÓSTICO TARDÍO “FALSO NEGATIVO” 1 neonato TIR1 96ng/ml [F508del] + [F508del] “ABANDONO DEL PROGRAMA” 1 Población magrebí [L227R] + [L227R] 1 Prematuro gemelar [F508del] + [F508del]

19 COSTES DEL CRIBADO NEONATAL DE LA FIBROSIS QUÍSTICA Estimación sobre recién nacidos/año y protocolo TIR±TIR±DNA Cribado bioquímico: Detección individual de FQ € Detección conjunta PKU+HC+FQ € Cribado genético (coste por muestra analizada): A) PCR / OLA 31 mutaciones € B) Análisis completo gen CFTR €

20 GENOTIPOS CF/CF EN 65 AFECTADOS

21 GENOTIPOS EN PORTADORES15 Genotipos / 70 portadores

22 GENOTIPOS CF / VARIANTE18 Genotipos / 31 neonatos

23 PROGRAMA DE CRIBADO NEONATAL EN BALEARESJordi Rosell  

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25 41725 39900 95 % 157 9 1 / 4.636 2001 2002 2003 2004 2005 Recién nacidos 9858 10420 10655 10792 > 11000 Analizados 9178 93% 9736 10426 97% 10560 98% 11000 ? ? Estudio molecular 37 36 32 52 60 / 15 Portador 3 2 4 Afecto 1

26 COSTE TIR 2,50 € ESTUDIO MOLECULAR 62 € TEST SUDOR 25 € TIR 27500 €TOTAL € Sobre / 1 % (+)

27 PROGRAMA DE CRIBADO NEONATAL EN GALICIA

28 Estudio Piloto Detección Precoz Fibrosis QuísticaInicio Año 2003 como Programa Piloto. Aprobado por el Comité de Investigación Clínica de Galicia. Área de Cobertura Galicia Tasa de Cobertura 98,7% de los recién nacidos vivos Método de cribado Determinación de tripsinógeno en sangre por Inmunofluorescencia (AutoDelfia) Método confirmación Cloro en sudor Potenciometría con dilución (3100 SWEAT-CHEK) Métodos confirmación genética INNO-LIPA Secuenciación completa gen CFTR

29 Resultados y Prevalencia en Cribado Neonatal2003 2004 2005 Total Frec. Niños analizados 19.911 20.424 21.057 61.392 98,7% Tripsinógeno elevado 1ªmuestra 139 154 164 457 0,74% Tripsinógeno elevado 2ªmuestra -- 28 56 84 0,20% Estudio genético 105 24 49 178 Portadores 5 4 s/d 9 1:4.482 Fibrosis Quística 2 6 1:10.232

30 Comparación una muestra con doble muestraUna única muestra (2003) Doble muestra (desde 2004) Precisión 99,27% 99,81% Sensibilidad* 100% Especificidad Valor predictivo positivo 0,013 0,048 Valor predictivo negativo* 1 Ratio probabilidad positiva 136,11 518,46 * No valorable, hasta ahora ningún caso falso negativo

31 Protocolo de Cribado InicialDeterminación de tripsinógeno en sangre >69 ng/mL <70 ng/mL Solicitud de 2ª muestra >39 ng/mL >60 mEq/L F. QUÍSTICA Confirmada Cloro en sudor positivo Mutaciones CFTR >39 mEq/L F. QUÍSTICA posible negativo <40 ng/mL NORMAL <40 mEq/L

32 Resultados y Prevalencia en Cribado Neonatal2003 2004 2005 Total Niños analizados 19.911 20.424 21.057 61.392 98,7% Tripsinógeno elevado 1ªmuestra 139 154 164 457 0,74% Tripsinógeno elevado 2ªmuestra -- 28 56 84 0,20% Estudio genético 105 24 49 178 Portadores 5 4 s/d 9 1:4.482 Fibrosis Quística 2 6 1:10.232

33 Casos positivos CribadoAño TIR ng/mL Cl mEq/L Alelo 1 Alelo 2 2003 76 elevado ? 177 DF508 2004 96 R334W 105 81 R1162X 2005 223 >100 2176insC 60 711+1G->A V232D

34 Resultados en Cribado

35 Protocolo de Cribado Actual>69 ng/mL <70 ng/mL Determinación de Tripsinógeno en sangre Positivo Mutaciones CFTR Un alelo Cloro en sudor Negativo F. QUÍSTICA Confirmada Dos alelos F. QUÍSTICA Posible Secuenc. Seguim,... >39 mEq/L <40 mEq/L NORMAL

36 Panel de mutaciones Cribado Neonatal Galicia

37 Valoración final Detección precoz fiable con alta especificidad y sensibilidad, aunque parece admitir mejora con la determinación simultánea de PAP y tripsinógeno Económico. Mismo precio que la determinación de TSH. Rápido. Resultados en el día en el caso de tripsinógeno y al mes en el cribado genético. Beneficio del diagnóstico precoz, previo a la aparición de sintomatología: Prevención de malnutrición, infecciones, etc.

38 Mutaciones localizadas en 82 casos FQ seguidos en Galicia21 casos sin identificar ninguna mutación 21 casos homocigotos DeltaF508 7 casos ausencia DeltaF508

39 PROGRAMA DE CRIBADO NEONATAL EN EXTREMADURAJesús María Remón Alvarez-Arenas

40 TOMA DE MUESTRA DE SANGRE DE TALÓNENVÍO A LA COORDINACIÓN PARA REGISTRO LABORATORIO - VALORACIÓN DE LA IRT (¿?) < 70 ngr./ml. > 70 ngr./ml. Sale del Programa Nueva muestra < 70 ngr./ml. > 70 ngr./ml. Test de sudor Estudio de mutaciones (33 mut. y polimorfismos)

41 POBLACIÓN Y RESULTADOS2003 2004 2005 1ª IRT normal 8.576 9.087 8.795 1ª IRT NO normal 51 50 47 2ª IRT normal 37 35 Confirmar estudio 4 13 12

42 PROGRAMA DE CRIBADO NEONATAL EN ARAGÓNMª Teresa Calvo

43 Protocolo Fibrosis Quística Mutaciones CFTR TIR a partir de las 48 h.< 60 ng/ml < 60 ng/ml repetir > 60 ng/ml > 60 ng/ml INFORME INFORME Mutaciones CFTR No mutación 2 mutaciones 1 mutación TIR día 21 Unidad FQ Test sudor normal < 40 ng/ml > 40 ng/ml Test sudor elevado Fibrosis Quística INFORME INFORME

44 Mutaciones CFTR

45 Mutaciones CFTR Mutación Número (%) p.F508del 75 (58,14) p.G542X12 (9,30) p.L206W 8 (6,20) p.N1303K 7 (5,43) p.I507del c.1609delCA 5 (3,88) p.S549R 2 (1,55) p.Q890X; c.712G>T; c G>A; c ,6kbA>G; c.71+1G>A; c.2184insA; c.1716G>A; p.Y1092X; p.I148T; p.R347P; c G>A; c A>G; p.R117H 1 (0,78)

46 Prevalencia estimada: 1/5.109R.N. con FQ: 2-3/año Portadores: 374 RN Costo de la prueba: 3 €

47 PROGRAMA DE CRIBADO NEONATAL EN MADRIDElena Dulín

48 Cribado Neonatal FQ en la CMACTUALMENTE: No se realiza PREVISIÓN FUTURA: Realizar estudio piloto durante al menos seis meses ( RN) OBJETIVO: Prevalencia y Oportunidad de Incorporación

49 l'AFDPHE

50 RN 1177 (0.58%) 48 = 1: 4266 45 (4%) 116 (10%) 1028 (86%) 43 (89.5%)

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52 Resumen 204.748 TIR (65) / ADN TIR(50) / PAP TIR 1177 (0.58%)3890 (1.89%) CFTR 2 Mutaciones 1 TIR 21 días 45 (3.8%) 116 (9.8%) 1028 (87.3%) 111 (10.8%) TIR (1x) TIR(2x) Test sudor 224 (0.11%) 501 (0.25%) 329 (0.16%) FQ 48 1.- A Munck el al. Archives de Pediatrie 12 (2005): 2.- J Sarles el al. J Pediatr 2005;147:302-5

53 Coste Estimado Total (€) 352900 282100 100.000 Precio Unitario (€)TIR / ADN TIR / PAP TIR 2.5 (100%) 250000 CFTR 120 (0.58%) 69600 2600 PAP 4.5 (1.89%)) - 18000 Test sudor 46 (0.11%- 0.25%) 5000 11500 TIR 21 días 23 (0.5%) Seguimiento 400 (0.4%) 16800 Total (€) 352900 282100 1.- A.Munck el al. Archives de Pediatrie 12 (2005): 2.- J Sarles el al. J Pediatr 2005;147:302-5

54 Estudio Piloto...... ESTUDIO ANÓNIMO NO RELACIONABLE: 35000 RNCENTRO CRIBADO NEONATAL DE LA CM: HGUGM Medición de TIR y PAP BIOLOGÍA MOLECULAR: HGUGM kit: CFTR19 y CFTR17+Tn COMPARAR ESTRATEGIAS: TIR/ADN versus TIR/PAP CONSENTIMIENTO INFORMADO  ADN

55 PROGRAMA DE CRIBADO NEONATAL EN MURCIAAsuncion Fernandez Sanchez

56 Protocolo Propuesto - < cut-off + > cut-off > cut-offMuestra sangre papel filtro (3-6 días), nivel IRT > cut-off Negativo Positivo Solicitar 2ª muestra, <20 – 30dias < cut-off > cut-off Negativo Positivo Est. Mut. en CFRT, kit 31 mut +A1006E + K710X 2 mut 1 mut Sin mut Test sudor Otras: D-HPLC, secuen, MLPA, + Heterocigoto/ AsesorGenético mut - FQ (Unidad) normal

57 RESULTADOS Incluidas en el KitPCR-OLA V3 de Abbott MUTACIONESNº cromosomas % Nº pacientes F508del * 50 34.2 40 54.8 G542X * 18 12.3 17 23.3 L206W 8 5.5 7 9.6 K710X 6 4.1 5 6.8 A1006E + 5T 3.4 N1303K * 4 2.7 2869insG G85E * 2 kbC>T * bkA>G 3 2.05 R334W * G>A * 1.4 21833AA>G * Q890X 711+1G>T * No encontrado 9 6.2 No hecho Incluidas en el KitPCR-OLA V3 de Abbott

58 El Kit PCR-OLA V3 (Abbott) incluye únicamente el 42El Kit PCR-OLA V3 (Abbott) incluye únicamente el 42.1% (16/38) de las mutaciones halladas en la población murciana y permitiría diagnosticar (por encontrar las 2 mutaciones) el 57.5% de los pacientes. Mutaciones de FQ relativamente frecuentes en Murcia no incluidas en el kit PCR-OLA V3 (Abbott) L206W: 7 pacientes (1 homozigoto) A1006E: 5 pacientes K710X: 5 pacientes (1 homozigoto) 2869insG: 4 pacientes kbA>G: 3 pacientes

59 Análisis económico: presupuestoNúmero Coste total euros (ptas) 1ª IRT recién nacidos 40.000 ( ) 2 ª IRT 800* (400pacientes) (análisis por duplicado) 1.600 ( ) ADN - extracción Kit (30 mut) D-HPLC/secuenciación 100 15 100 (16.700) 1.000 ( ) 1.500 ( ) TOTAL 44.200 ( ) Se precisa la incorporación de 2 TEL ( euros) y un auxiliar administrativo al Centro de Bioquímica y Genética Clínica ( euros) Total coste programa euros Total coste por paciente FQ (¿frecuencia?)