1 Protein Sentezi ve Posttranslasyonel Modifikasyonlar

2 DNA’da bulunan nükleotidler, 3 harfli kodlar (kelimeler) şeklinde organize olmuştur. Bunlara kodon denir. DNA’daki nükleotid sekansı/dizisi, öncelikle, nükleusta, komplementer/tamamlayıcı şekilde RNA’ya transkript edilir; ardından farklı sınıflara ait RNA molekülleri, transkript edilen genetik bilginin ışığında protein sentezini yönlendirir.

3 Protein sentez süreci “translasyon” olarak adlandırılmaktadır.Bunun sebebi nükleotid sekansından oluşan “dil”in; amino asit sekansından oluşan “yeni bir dil”e tercüme edilmesidir.

4

5 21. amino asit: SelenosisteinmRNA üzerinde özel bir sekans (selenocysteine insertion sequence (SECIS)) mevcut olduğunda, UGA kodonu stop kodonu olarak değil selenosistein kodlayan bir kodon olarak işlev görür. Bakterilerde SECIS, okuma alanı içerisinde ve UGA kodonuna yakın yerleşimli iken; ökaryotlarda transleyt edilmeyen 3‘ bölgesindedir (3’-untranslated region (3' UTR)). Şu ana kadar (2016 itibarıyla), insanlarda selenosistein içeren 54 protein tespit edilmiştir (selenoprotein).

6

7

8 Pirolizin UAG kodonu, özel iki genin (pylT ve pylS) ve bu genlerin ürünü olan özel tRNA ve aminoaçil-tRNA sentetaz ürünlerinin mevcudiyetinde, pirolizin şeklinde ifade edilir. Pirolizin (Pyl), yalnızca bazı prokaryotlarda tespit edilmiştir (insanlarda yoktur!).

9 Lizin Pirolizin

10 Genetik Kodun ÖzellikleriSpesifik: Bir kodon daima aynı amino asidi kodlar. Evrensel/Standart: Evrimsel olarak korunmuştur ve bütün canlılar için ortaktır. Bunun bazı istisnaları olabilir. Mesela mitokondride UGA, triptofanı kodlar. Dejenere: Bir kodon yalnızca bir amino asidi kodlamakla birlikte; bir amino asit için birden fazla kodon olabilir. Örneğin hepsi de arjinini kodlayan 6 farklı kodon vardır. Noktalamasız/kesintisiz: Bir kodonu (3 harfli kelimeyi) bir diğeri takip eder. Kodonlar/kelimeler arasında başka bir şey yer almaz. Mesela; AGCUGGAUACAU şöyle okunur: AGC UGG AUA CAU.

11 Genetik kodun evrenselliğinin bazı istisnaları

12 mRNA üzerindeki tek bir bazın değişmesine yol açacak genetik değişiklik (DNA’da nokta mutasyonu), 3 muhtemel sonuç doğurur: Sessiz (silent) mutasyon: Değişiklik sonucu yine aynı amino asit kodlanır. Örneğin; UCA yerine UCU olsa bile, bu kod yine serine ait olacaktır. Missens (yanlış anlamlı) mutasyon: Sentezlenecek olan amino asit değişir. Örneğin; UCA yerine CCA olursa, serin yerine prolin sentezlenmiş olur. Nonsens (anlamsız) mutasyon: Mutasyon stop kodonun oluşmasına yol açar. Örneğin; UCA yerine UAA olursa, serin sentezlenmesi gerekirken translasyon durur. Böyle mutasyonlar sonucu kesik/kısa proteinler sentezlenir.

13 Protein Sentezi İçin Gerekli BileşenlerAmino asitler Taşıyıcı RNA’lar Enzimler ve non-enzim proteinler Aminoaçil-tRNA-sentetazlar Ribozomlar Ribozomal RNA’lar Enerji kaynakları Transkript edilecek mRNA

14 Amino Asitler

15 Transfer RNA (tRNA) (Taşıyıcı RNA)tRNA molekülleri 3 major RNA tipinin en küçüğüdür. tRNA moleküllerinde anormal bazlar bulunabilir. Zincir içi baz eşleşmeleri vardır. Standart 20 amino asidin her biri için, en az 1 tane spesifik tRNA vardır. Amino asit, tRNA’nın 3’-ucuna ester bağı ile bağlanır.

16

17 tRNA şu kısımlardan oluşur:5’-P uç Akseptör (alıcı) kök Dihidroüridin içeren D kolu (aminoaçil-tRNA sentetaz için tanınma bölgesi) Antikodon kolu T kolu (TΨC) (Ψ: pseudouridin) (ribozom için tanınma bölgesi) CCA-3’-OH uç

18

19 Aminoacyl tRNA SynthetaseAmino asidi, antikodonu uyumlu spesifik tRNA’sına bağlar. Bu esnada ATP yıkılarak AMP açığa çıkar. Her amino asit için spesifik aminoaçil-tRNA sentetaz enzimi vardır. İlgili animasyon: https://www.youtube.com/watch?v=W1eQNmtCCkw

20

21 Ribozomal RNA (rRNA) Protein sentezinde ribozomal RNA, bir katalizör olarak işlev görür (ribozim). Prokaryotlarda ve ökaryotik mitokondrilerde 23S, 16S ve 5S; ökaryotik hücrelerin sitoplazmalarında ise, 28S, 18S, 5.8S ve 5S rRNA vardır.

22 Svedberg birimi (S) Ultrasantrifüjdeki çökme hızı.Bir molekülün ağırlığı ve şekli S değerini belirler. Daha ağır ve daha kompakt moleküller, daha hızlı çökerler ve daha yüksek bir Svedberg değerine sahiptir.

23 Ribozomal RNA (rRNA)

24 Protein Sentezinin AşamalarıProtein sentezi süreci; mRNA üzerindeki 3 harfli kelimelerden (kodonlardan) ibaret nükleotid sekansı dilini, proteinlerin yapısını ifade eden 20 harflik amino asit diline çevirir. mRNA, 5’-uçtan 3’-uca doğru okunarak çevrilirken; N-terminal’den C-terminale doğru bir protein de sentezlenmiş olur.

25 Prokaryotik mRNA’lar sıklıkla birkaç kodlayıcı bölgeye sahiptir (polisistronik = poligenik).Oysa ökaryotik mRNA’lar, sadece bir kodlayıcı bölgeye sahiptir (monosistronik).

26

27 Protein Sentezinin AşamalarıTranslasyon süreci 3 aşamada yürür: Başlangıç (initiation) Uzama (elongation) Sonlanma (termination)

28 Başlangıç Protein sentezinin başlaması için şu komponentlerin bir arada bulunması gerekir (başlangıç kompleksi): Büyük ve küçük ribozomal subunit Transleyt edilecek mRNA İlk kodonun aminoaçil-tRNA’sı (başlatıcı tRNA) GTP İnisiasyon (başlangıç) faktörleri Prokaryotlarda, IF-1, IF-2, IF-3 Ökaryotlarda çok sayıda eIF

29 Başlangıç Kodonunun TanınmasıProkaryotlarda: 16S rRNA’nın, mRNA üzerindeki Shine-Dalgarno sekansı ile eşleşmesi Ökaryotlarda: eIF-4 üyelerinin yardımıyla küçük ribozomal subunitin 5’-kep’i bağlayıp, AUG kodonuna ulaşması (ATP gerektirir!)

30 Shine-Dalgarno SekansıE.coli’de mRNA üzerinde AUG kodonundan 5’ uca doğru (upstream) yaklaşık 5-10 bazlık mesafede pürin nükleotidlerinden zengin bir sekans bulunur.

31 Küçük ribozomal subunitin (30S), 16S’lik ribozomal RNA’sı kendi 3’-ucuna yakın, Shine-Dalgarno sekansına kısmi veya tam komplementer bir sekansa sahiptir.

32 Böylece mRNA’nın 5’ ucuna yakın Shine-Dalgarno sekansı ile, 16S rRNA’nın 3’ ucuna yakın komplementer sekans eşleşerek, protein sentezinin başlaması için AUG kodonunun pozisyon almasını temin eder.

33 5’-Cap Ökaryotik mRNA’lar Shine-Dalgarno sekansına sahip değildir.Ökaryotlarda, mRNA 5’-ucunda 5’-5’-trifosfat bağlarıyla bağlanmış 7-metilguanozin’den oluşan bir “cap (şapka)” taşır (5’-kep). Ökaryotlarda küçük ribozomal subunit (40S), eIF-4 yardımıyla, mRNA’nın 5’ ucundaki şapka yapısını bağlar ve AUG kodonuna ulaşıncaya kadar mRNA üzerinde aşağıya doğru hareket eder. Bu “tarama” işlemi için ATP gereklidir.

34 5’-kep

35

36 5’-kep bağlayıcı eIF-4 proteinleri ve poli-A kuyruk bağlayıcı proteinler arasındaki etkileşimler sayesinde ökaryotik mRNA sirküler (halkasal) bir yapı kazanır.

37

38 Başlama Kodonu AUG kodonu özel bir tRNA tarafından tanınır (başlatıcı tRNA). Bu tanınma işlemi, prokaryotlarda IF-2-GTP; ökaryotlarda ise eIF-2-GTP ve ilave inisiasyon faktörleri ile kolaylaştırılır. Yüklü başlatıcı tRNA, küçük subunit üzerindeki P bölgesine girer. Direkt olarak P bölgesine giren tek tRNA; başlatıcı tRNA’dır.

39 IF-2 ve eIF-2 sadece başlama kodonuyla uyumlu olan başlatıcı tRNA’yı tanır.Bakterilerde ve mitokondride, başlatıcı tRNA; N-formil metiyonin (fMet) taşırken; ökaryotlarda metiyonin taşır.

40

41 N-formil metiyonin

42

43 Ökaryotlarda başlatıcı tRNA’nın taşıdığı metiyonin formillenmez.Hem ökaryotlarda, hem de prokaryotlarda proteinlerin N-terminal ucunda bulunan metiyonin, genellikle translasyon tamamlanmadan önce çıkarılır.

44 Büyük ribozomal subunitin bağlanmasıyla beraber, başlangıç kompleksi tamamlanmış olur (P bölgesinde yüklü başlatıcı tRNA içerir; A bölgesi ise boştur). Spesifik IF’ler, büyük subunitin erken bağlanmasını önler.

45

46

47 Uzama (Elongasyon) Uzama süreci, büyüyen polipeptit zincirine C-terminal uçtan yeni amino asitlerin eklenmesiyle olur. Bu süreçte, ribozom, mRNA’nın 5’ ucundan, 3’ ucuna doğru hareket eder.

48 Elongasyon FaktörleriEF-Tu-GTP (elongation factor thermo unstable -GTP): Sitoplazmada aminoaçil-tRNA bağlar ve oluşan kompleks ribozoma A bölgesinden girer. EF-Ts (elongation factor thermo stable): EF-Tu için bir guanin nükleotid değiştirme faktörüdür; EF-Tu’dan guanozin difosfatın (GDP) salınımını katalizler. Böylece EF-Tu yeniden GTP bağlayabilir.

49

50 Peptit bağının oluşumu, büyük (50S) ribozomal subunitte bulunan 23S ribozomal RNA’nın peptidiltransferaz aktivitesi ile katalizlenir. Bunun ökaryotlardaki karşılığı; 60S subunitin 28S’lik rRNA’sıdır.

51

52 Oluşan peptit bağı ile, P bölgesindeki tRNA’ya bağlı olan peptit zinciri, A bölgesindeki tRNA’ya bağlı amino aside aktarılmış olur. Daha sonra, ribozom, mRNA’nın 3’ ucuna doğru 3 nükleotit kadar ilerler (translokasyon). Translokasyon için, prokaryotlarda EF-G-GTP; ökaryotlarda EF-2-GTP’ye ihtiyaç duyulur (GTP hidroliz edilir). Translokasyon ile, yüksüz hale gelen tRNA, P bölgesinden E bölgesine kayarken; peptidil tRNA da A bölgesinden P bölgesine hareket etmiş olur.

53 Sonlanma (Terminasyon)Sonlanma; A bölgesi, 3 terminasyon kodonundan birine (UAA, UAG, UGA) ulaşınca meydana gelir. E.coli’de bu 3 kodon sonlanma/salıverme faktörleri (release factor; RF) tarafından tanınır.

54 RF-1: UAA ve UAG’yi tanır.RF-2: UAA ve UGA’yı tanır. Bu faktörlerin bağlanması; P bölgesindeki tRNA’dan peptidin ayrılmasına yol açar. RF-3-GTP: RF-1 ya da RF-2’nin salınımına neden olur (GTP hidroliz edilir).

55 Ökaryotlar tek bir salıverme faktörüne (eRF) sahiptirÖkaryotlar tek bir salıverme faktörüne (eRF) sahiptir. Bu faktör, her üç terminasyon kodonunu da tanır. Ökaryotik eRF-3 ise prokaryotik RF-3 gibi işlev görür.

56 Terminasyon/SonlanmaHücre Faktör Görev İnisiasyon/Başlama Prokaryot IF-2-GTP Yüklü başlatıcı tRNA’yı P bölgesine kazandırmak Ökaryot eIF-2-GTP IF-3 Ribozomal subunitlerin ilişkisini önlemek eIF-3 Elongasyon/Uzama EF-Tu-GTP Diğer yüklü tRNA’ları A bölgesine kazandırmak EF1α-GTP EF-Ts Guanozin nükleotid değiştirme faktörü EF1βγ EF-G-GTP Translokasyon EF-2-GTP Terminasyon/Sonlanma RF-1, RF-2 Stop kodonlarını tanıma, tRNA’dan peptidin ayrılması eRF RF-3-GTP Diğer RF’lerin salınımı eRF-3-GTP

57 Prokaryotlarda ve Ökaryotlarda Protein Sentezi Animasyonlarıhttps://www.youtube.com/watch?v=KZBljAM6B1s https://www.youtube.com/watch?v=qIwrhUrvX-k

58 Polizomlar mRNA’lar aynı anda birden fazla ribozom tarafından transleyt edilebilir. 1 mRNA molekülü ve 2 ya da daha fazla ribozomdan oluşan komplekse polizom/poliribozom denir.

59 Harcanan Enerji 1 amino asidin zincire ilavesi için 4 yüksek enerjili bağ yıkılır: 2’si aminoaçil-tRNA sentetaz reaksiyonunda (ATP -> AMP) 1’i yüklü tRNA A bölgesine bağlanırken (GTP -> GDP) 1’i translokasyon için (GTP -> GDP)

60 Posttranslasyonel Modifikasyon Örnekleri

61 Öncül/İnaktif Proteinlerin Yıkımı ile Aktif Proteinlerin Sentezi

62

63 C-peptit, hücrelerden insülinle birlikte salınır (endojen insülin sekresyonunun belirteci).Dışarıdan insülin alan hastalarda, hastanın kendi insülin salgısı hakkında dolaylı olarak fikir verir. Ayrıca karaciğer portal dolaşıma salınan insülini farklı oranlarda metabolize edebilir. Oysa C-peptit için bu geçerli değildir. Bu nedenle, C-peptit; insülinin kendisinden daha iyi bir insülin salgısı belirtecidir. Pankreas beta hücre aktivitesini ve kapasitesini yansıtır.

64 Fosforilasyon Kinazlar ATP’nin terminal fosfat grubunu proteinlere transfer ederek onların aktivite durumunu değiştirir (ya aktif veya inaktif yapabilir). Proteinlerde fosfat grubu nakledilen amino asitler hidroksil grubu taşıyan serin, treonin ve daha az sıklıkla da tirozindir. Sonuçta fosfo-ester bağı oluşur.

65

66

67

68 Glikozilasyon Hücre membranında görev yapacak olan veya hücreden sekrete edilecek olan proteinlerin çoğu karbonhidrat eklenerek glikozillenir. Bu süreç proteine bir “kimlik” kazandırır.

69 Hidroksilasyon Kollajende, prolin ve lizin rezidüleri, vitamin C varlığında hidroksillenir. Hidroksillenme yapıyı stabilize eder. C vitamini eksikliğinde (skorbüt hastalığı); kollajen sentezi bozulur;gingival, intramüsküler vb. kanamalar görülebilir.

70

71

72 Diğer ModifikasyonlarKarboksil gruplarının ilavesi (karboksilasyon) Kanın pıhtılaşmasında görev alan bazı proteinlerin (Faktör 2, 7, 9, 10) aktivitesi için önemli Biotin bağlanması Bazı enzimlerin aktivitesi için önemli Asetilasyon Histon proteinlerinin asetilasyonu gen ekspresyonunu etkiler

73