1 Proteínas Bioquímica, CHEM 4220 Universidad Interamericana de PRRecinto de Bayamón Prof. J. Roberto Ramirez Vivoni Prof. Alberto L. Vivoni Alonso Versión 2014

2 Funciones de proteínasEnzimas Anticuerpos de transporte Regulatorias Estructurales de movimiento

3 Clasificación de proteínasGlobulares - estructura tridimensional. Ej. Enzimas, hemoglobina, insulina, caseina Fibrosas –estructuras de 1 ó 2 dimensiones (fibras o láminas) Ejemplos: queratinas (pelo, uñas), miosinas (músculos), colágeno (tejido conectivo) Conjugadas – Contienen grupos prostéticos (un grupo no-amino adicional) Transmembranales– atraviesan la membrana celular Glucoproteínas - Se encuentran en la membrana y actuan en reconocimiento y secreción Lipoproteínas – complejos tipo micelas que transportan triglicéridos y colesterol en la sangre.

4 Levels of structure

5 Angulos f y y

6 Ramachandran Plots

7 Preguntas Cuando f = 180° y y = 0°, ¿qué grupos tendrían interferencia estérica? ¿Se esperaría que una hélice “right handed” fuese estable con ángulos f y y de -57° y -47° respectivamente? ¿Y si fuesen 82° y -105°?

8 Láminas plegadas b: paralelas y anti-paralelas

9 Puentes de hidrógenos de láminas b

10 Hélices a

11 Puentes de H en hélices a

12 Características estructurales de las hélices aEl oxígeno de cada carbonilo está unido por puente H con un H amído que queda 4 aminoácidos alejado. Cada vuelta cubre 5.4 Å, y posee 3.6 aminoácidos. Los grupos R quedan hacia afuera.

13 Cálculo de hélice a Determine la longitud (en Angstroms*) de una pieza con contiene 8 aminoácidos. *1 Angstrom = metros

14 Estructuras 2°: helice, láminas y conectores

15 Ejemplo de proteínas fibrosas: colágeno

16 Características estructurales de colágenoRepetición de -Gly-X-Y- Gly y Pro componen aproximadamernte 30% y 20% respectivamente Cada vuelta de la hélice cubre 0.94 nm y posee 3.0 aminoácidos. Pregunta: ¿Cuántos aminoacidos hay 3.2 nm de longitud de una hélice de colágeno?

17 Estructura 3° de mioglobina

18 Estructura 4° de Hemoglobina

19 Posición de los aminoácidos en las estructuras de proteínasSe encuentran hacia la superficie de las proteínas Se encuentran hacia el centro de las proteínas Favorecen formación de helices a Desfavorecen la formación de helices a Favorecen la formación de laminas b Se encuentran en alto porcentaje en proteínas fibrosas Polares y con carga No-polares Sin carga, hidrofóbicos: Ala, Leu, Met, Val, Phe Pro, Gly, Tyr, Asn, Trp, Ile cadenas laterales con carga, voluminosas y contínuas Cadenas laterales pequeñas: Gly, Ala Gly, Pro, Ala

20 Preguntas A pH 7.4, en qué parte (centro o superficie) de una proteína globular se encontrarían los siguientes residuos: Ser, Glu, Thr, Phe, His, Val, Asn, Leu, Cys. Prediga cual sería la estructura de polipéptidos con las siguientes segmentos repetitivos: a) Poli(Gly-Ala-Gly-Thr) b) Poli(Glu-Ala-Leu-His) 3. Explique porqué el polipéptido poli-L-Glu forma hélices a a pH 2 pero no a pH 7.

21 Termodinámica de Proteínas: Energía libre de GibbsDG = DH – TDS Criterio de espontaneidad DG < 0: espontáneo DG > 0: no-espontáneo DG = 0; equilibrio

22 Relación entre DG, DH, DS y TEspecifique las temperaturas a las que las siguientes combinaciones de DH y DS propiciarían procesos espontáneos. +DH -DH +DS -DS

23 Procesos termodinámicos de proteínasDH DS Doblamiento Solubilidad Dimerización Metabolismos Interacción ligando-receptor

24 DG y equilibrio Calcule K para una reacción de dimerizacióncon los datos en la tabla y la ecuación: DG = -RTlnK 2 monómeros ↔ dímero T(°C) DH(kJ/mol) DS(kJ/mol) DG(kJ/mol) 4 1.0 24 45 0.0157

25 Fuerzas que mantienen estructuras 3° y 4°Fuerzas London (van der Waals) entre grupos R que son no-polares e hidrofóbicos. Puentes H entre grupos R polares. Puentes salinos entre aminoácidos de carga opuesta Puentes disulfuros entre cisteinas (cistina)

26 Desnaturalización de proteínasTemperatura pH solventes orgánicos y detergentes metales pesados estres mecánico

27 Efecto de temperatura Coagulación - cuando las hebras desnaturalizadas se entrelazan y se hacen insoluble

28 Efecto de temperatura en enzimas

29 Efecto de pH

30 Desnaturalización por ácido o base

31 Desnaturalización por alcohol

32 Desnaturalización por agentes reductores

33 Separacion/purificacion y caracterizaciónCaracteristicas físicas Técnica experimental Tamaño Solubilidad Carga Polaridad Diálisis Filtración en gel Ultracentrifugación Espectrometría de masa Precipitación Electroforesis Intercambio iónico 4. Cromarografía de adsorción

34 Peso molecular Mr o MW (Molecular Weight): masa molecular relativa a 1/12 la masa de carbono (sin dimensiones) MM (Masa Molar): masa de 1 mol (g) Masa Molecular: Masa actual en unidades de masa atómica (dalton: Da, kDa, 1 Da = 1.66x10-24 g)

35 Preguntas Se encontró que una proteína que contiene el grupo hemo es 0.426% Fe por peso. Cuál es su masa molecular mínima? Treonina constituye 1.8% por peso de contenido de aminoácido de insulina. Cuál es la masa mínima de insulina si hay una treonina por molécula de insulina? Una proteína contiene 0.326% por peso de Fe. Cuál es su masa molecular?

36 Masa aproximada De acuerdo a la proporción de aminoácidos en la mayoría de las moléculas, la masa promedio de un residuo es 110 Da. Cuál es la masa molecular aproximada de citocroma c el cual tiene 104 residuos y un grupo hemo (Mr=412)?

37 Separacion por peso/tamañoDiálisis Filtración en gel

38 Pregunta ¿En qué orden emergerían las siguientes proteínas en una columna de filtración-gel cuya matriz de gel tiene poros de ~200,000: mioglobulina (Mr = 16,000), catalasa (Mr = 500,000), citocroma c (Mr = 12,000), quimotripsinógeno (Mr = 26,000) y hemoglobina (Mr=66,000).

39 Ultracentrífugación

40 Ultracentrifugación analíticaEcuación de Svedberg MM = RTs/D(1-m0) s: coeficiente de Svedberg (s) R: constante universal de gases (J/Kmol, J: kgm2/s2) T: temperatura (K) D: difusión (m2/s) m0: fracción de masa de solvente desplazada

41 Pregunta Calcule la masa de una proteína con los siguientes datos experimentales: s = 4.2 x s D = 1.2 x m2/s mo = 0.719

42 Solubilidad Control de precipitación:Controlando el pH: las proteínas son menos solubles cuando el pH del medio es igual a su pI Aumentando la polaridad del medio Aumentando la no-polaridad del medio

43 Electrophoresis* *pH dependent

44 Pregunta En qué dirección se moverían las siguientes moléculas en un campo eléctrico a los pH indicado? Albúmina (pI= 4.9) a pH 8.0 Ureasa (pI=5.0) a pH 3.0 y 9.0 Ribonucleasa (pI=9.5) a ph 4.5, 9.5 y 11.0 Pepsina ((pI=1.0) a pH 3.0, 7.0 y 9.5 Hemoglobina A tiene un pI = 6.9. Una variante, hemoglobina M, tiene un residuo de glutamato en la posición 67 en vez de valina. Qué efecto tiene esta sustitución en el comportamiento electroforético a pH 7.5.

45 Cromatografía Papel Capa fina Intercambio iónicoCromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)

46 Intercambio iónico Intercambio anónico: intercambian anionesIntercambio catiónico: intercambian cationes

47 Pregunta Una solución de albumina de huevo (pI = 4.6), b-lactoglobulina (pI = 5.2) y quimotripsinógeno (pI = 9.5) se introducen a una columna de cromatografía de intercambio iónico compuesta de un grupo amonio con carga positiva a un pH de 5.4. La columna luego se eluyó con un amortiguador de 5.4 con un aumento en la concentración salina. ¿En qué orden saldrían estas proteínas de la columna y porqué?

48 Pregunta Ovalbúmina (pI=4.6), ureasa (pI=5.0) y mioglobina (pI=7.0) se agregan a una columna de intercambio iónico con una resina con carga positiva a un pH de 6.5. La columna luego se eluye con un amortiguador de 6.5 con un aumento en concentración de NaCl. En qué orden salen las proteínas de la columna?

49 Caracterización Peso molecular: Estructura: Espectrometría de masaUltracentrigufugación analítica Estructura: Rayos X Resonancia magnética nuclear (“NMR”) Dichroismo circular