1 Proteínas de Reconocimiento de Patógenos Infecciosos: Proteínas de Reconocimiento de Peptidoglican Pablo Aguilar Maria Jose Acuña Maria Gabriela Alvarado

2 Proteínas de reconocimiento de peptidoglican Presente en moluscos, insectos, equinodermos y vertebrados Proteínas transmembrana con al menos un grupo carboxi-terminal de dominio PGRP (Peptidoglican Recognition Proteins)en el extremo externo (hacia la matriz extracelular

3 Reconocimiento y defensa contra: Microorganismos Virus Sustancias potencialmente perjudiciales para el organismo Respuesta Inmune

4 Inmunidad InnataAdquirida Humoral Sistemas de complemento Celular Macrofagos Granulocitos Celulas NK Humoral Anticuerpos Celular Linfocitos Celulas dendriticas

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7 Inmunidad Innata Sistema más antiguo y común en el reino animal Detecta microbios a través de un juego limitado de receptores codificados por lineaje germinal y el sistema no mantiene record (no tiene memoria) de los microbios que ya han pasado por el sistema Barreras propias del cuerpo que no permiten la entrada de materiales nocivos al cuerpo. Primera línea de defensa de la respuesta inmune. La piel, el ácido estomacal, la mucosa, el reflejo de la tos, enzimas en las lágrimas y las grasas de la piel.

8 -El peptidoglican se encuentra en la membranas de bacterias y actúan también como una barrera de inmunodeficiencia innata. - En la inmunidad innata de los animales hay procesos de reconocimiento para el peptidoglican de las bacterias

9 Reconocimiento de peptidoglican en el sistema inmune innato

10 Composición de las membranas de las bacterias -Las paredes celulares de las bacterias y las cianobacterias (eubacterias) son rígidas y están compuestas por una red de polisacáridos llamada peptidoglicán. -La cantidad de peptidoglican presente en las paredes celulares de las bacterias varía de acuerdo a la especie y es una de las bases para la clasificación de las bacterias.

11 - Al realizar una tinción en ellas basada en una solución de cristal violeta se pueden identificar las bacterias: Gram Positivas Gram Negativas. -La tinción diferencial de Gram se utiliza para distinguir cantidad de peptidoglican sobre la membrana plasmática de las bacterias -El método se basa en teñir el peptidoglican con violeta cristal y un mordiente (Yodo) por el que el peptidoglican tienen mucha afinidad y luego lavar con alcohol.

12 Gram positivas Gram negativas

13 Gram positivas -Las bacterias Gram+ se tiñen de violeta. -Poseen una gran cantidad de peptidoglican sobre la membrana plasmática. -Los receptores de peptidoglican generalmente actúan sobre estas bacterias

14 Gram negativas -Bacterias que tienen una capa muy delgada de peptidoglican entre la membrana plasmática y una capa externa de lipopolisacáridos. -Los lipopolisacaridos son los que generalmente producen infecciones. -Las bacterias Gram – se tiñe con safranina y se tornan color rosado.

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16 Peptidoglican Polímero de carbohidratos y amino ácidos (PEPTIDOS) Forma una capa homogénea en la parte externa de la pared celular bacteriana Capa más gruesa en bacterias Gram-positivas Protección, estructura, sostén, fisión binaria

17 Cadenas lineares alternando dos azúcares: N-acetil glucosamina (NAG) y N-acetil ácido murámico (NAM) Los azúcares alternantes se unen mediante enlaces B-1,4 glicosídicos Cada NAM se encuentra unido a una cadena de amino ácidos corta (por lo general contiene alanina y ácido glutámico)

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19 Naturaleza de la PGRP La parte del receptor de tanto los PGRPs como los PGLYRPs * son de naturaleza peptídica, y al unirse con el muramil-tri/tetra/penta péptido del peptidoglican se forma una unión péptido-péptido, la cual es muy fuerte. *Cuando los PGRPs se encuentran en el cuerpo humano su nomenclatura cambia a PGLYRPs. Y existen cuatro tipos.

20 Complejo Receptor Ligando

21 Estructura Tienen receptor para peptidoglican en uno (o varios) de sus dominios de PGRP La mayoría tiene dos cisteínas cercanas en la parte media del dominio PGRP para formar un puente disulfuro Dominio hidrofóbico del lado opuesto de la molécula a donde se encuentre el receptor de peptidoglican

22 A: Fragmento de peptidoglican B: Estructura del complejo PGRP y MTP (muramil tripéptido) C: Mapa de densidad electrónica del ligando MTP

23 Unión PGRP- peptidoglican Tallo del péptido del ligando se inserta al fondo del receptor N-acetyl ácido murámico en el medio del receptor Receptor puede acomodar en parte superficial N-acetilglucosamino Se forman puentes de hidrógeno entre NAM y PGRP

24 Contacto intermolecular entre complejo PGRP-MTP

25 PGRPs en insectos Transducción de señales de inmuno deficiencia Se inducen cascadas proteolíticas que generan 1.Productos antimicrobiales 2.Inducción de fagocitosis 3.Hidrolización del peptidoglican Protegen contra infecciones

26 En los insectos los PGRPs NO son efectores, a excepción de: PGRP-SC1B Proteína soluble Ha demostado actividad catalítica con el peptidoglican Hidroliza enlace entre azúcar y péptido

27 Proteínas Toll Proteína en la membrana involucrada en inmunidad innata y funciona creando una secuencia de señales al ser activado mediante fungi o bacterias Gram + La activación de Toll induce la creación de péptidos antibacterianos (ej. Drosomysina, Gram+ y Diptericina, Gram-) PGRPs elementos necesarios para inducción de efecto de Toll debido a que las Toll son proteínas muy conservadas y no reconocen el peptidoglican tan bien como los PGRPs

28 Mecanismo de reconocimiento receptores Toll

29 Reconocimiento de peptidoglican en mamíferos Nods 1.Nueva familia de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) intracelulares 2.Tienen receptores involucrados en detección de peptidoglican PGRPs 1.4 tipos 2.Contienen sitio de anclaje para peptidoglican 3.Se localizan en membranas 4.Pueden estar empaquetadas en vesículas

30 PGRPs en mamíferos PGLYRP-2 : 1.Hidroliza el peptidoglican de las bacterias 2.Antibacteriales 3. Reduce su actividad proinflamatoria 4. Se secreta del hígado al torrente sanguíneo o la presencia de bacterias en el epitelio la induce TODOS LOS PGLYRPs SON SOLUBLES EN MEDIO ACUOSO

31 PGLYRP-1, PGLYRP-3, PGLYRP-4: 1.Matan bacterias al interactuar con pared celular, en lugar de permeabilizarla como lo hacen la mayoría de las proteínas antibacterianas 2.Bactericidas 3.Se cree que la actividad bactericida de estas PGRPs evolucionó para los vertebrados, ya que por el momento no se han descubierto rastros en insectos

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33 Funcionamiento PGLYRPs: Al interactuar con membrana interfiere con funcionamiento normal de la bacteria y su crecimiento Requieren calcio y N-glicosilación para llevar a cabo actividad bactericida Bactericidas (matan 99% de baterias) Proteínas de reconocimiento y de actividad

34 Mecanismo General Dominio carboxi-terminal de PGLYRP-1 y PGLYRP-3 tienen receptores específicos para el peptidoglican, en específico para el muramil-tri/tetra/penta péptido Al haber contacto se da un cambio conformacional y la proteína se une en forma permanente a la pared celular bacteriana

35 Propuesta de mecanismo de PGRP con base en PGRP-SC 1B Ion Zn 2+ actúa como catalítico eletrofílico Zn 2+ acepta par de electrones de carbonilo en NAM, polarizándolo El carbonilo se vuelve suceptible a un ataque nucleofílico por parte del agua catalítica unica al Zn 2+

36 OTROS MECANISMOS INVOLUCRADOS EN EL RECONOCIMIENTO DE BACTERIAS Nods (solo en mamiferos)  otra forma de reconocimiento de peptidoglican aparte de los PGRPs, pero independientes de los mecanismos Toll Proteina LC (en Drosophila Melanogaster) Heat Shock Proteins Toll- Like receptors

37 Nods 1.Proteínas citoplasmáticas 2.Funcionan mediante mecanismos que parecieran ser independientes al Toll 3.Nod1=> en el citosol de células epiteliales infectadas con Gram- Nod2=>expresión más pronunciada en células de lineaje mieloide (sensor general de Gram + y - )

38 Cryoprina El receptor de peptidoglican que ha sido reportado más recientemente, y todavía no se conoce mucho de él.

39 Mutaciones de Nod2 y cryoprina Han sido asociados al desarrollo de enfermedades inflamatorias 1.Muckle Wells Syndrome (MWS) 2.Familial cold autoinflamatory syndrome (FCAS) 3.Chronic infantile neurological cutaneuos and articular syndrome (CINCA)

40 Limitaciones A pesar del progreso en los últimos años, este sigue siendo un tema del que se conoce muy poco Queda por saber: 1.Estructuras y especifidades de PGRPs de insectos y mamíferos 2.Funciones y algunos mecanismos de PGRPs de insectos 3.Funciones múltiples y desconocidas de PGRPs de mamíferos, junto con su mecanismo de se desconoce por completo 4.El papel que juegan los PGRPs in vivo y sus asociaciones clínicas

41 Fuentes The role of peptidoglycan recognition in innate immunity. Stephen E. Girardin and Dana J. Philpott. Peptidoglycan and innate immunity. Eur. J. Immunol. 2004. 34: 1777–1782. © 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim Structural basis for peptidoglycan binding by peptidoglycan recognition proteins. Rongjin Guan, Abhijit Roychowdhury, Brian Ember, Sanjay Kumar, Geert-Jan Boons, and Roy A. Mariuzza. PNAS. December 7, 2004. Vol1. No. 49. Peptidoglycan Signaling in Innate Immunity and Inflammatory Disease. Christine McDonald, Naohiro Inohara, and Gabriel Nuñez. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. Vol. 280, No. 21, Issue of May 27, pp. 20177–20180, 2005 © 2005 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc. Mammalian PGRPs: novel antibacterial proteins. Roman Dziarski* and Dipika Gupta. Indiana University School of Medicine-Northwest, Gary. © 2006 The Authors. Journal compilation © 2006 Blackwell Publishing Ltd, Cellular Microbiology, 8, 1059–1069 Peptidoglycan Recognition Proteins A NOVEL FAMILY OF FOUR HUMAN INNATE IMMUNITY PATTERN RECOGNITION MOLECULES. Chao Liu, Zhaojun Xu, Dipika Gupta, and Roman Dziarski. From the Northwest Center for Medical Education, Indiana University School of Medicine, Gary, Indiana. July, 2001 Peptidoglycan Recognition Proteins Are a New Class of Human Bactericidal Proteins. Xiaofeng Lu, Minhui Wang, Jin Qi, Haitao Wang, Xinna Li, Dipika Gupta, and Roman Dziarski. From the Indiana University School of Medicine-Northwest, Gary, Indiana. December, 2005 Dual strategies for peptidoglycan discrimination by peptidoglycan recognition proteins (PGRPs). Chittoor P. Swaminathan, Patrick H. Brown, Abhijit Roychowdhury, Qian Wang, Rongjin Guan, Neal Silverman, William E. Goldman, Geert-Jan Boons, and Roy A. Mariuzza. Center for Advanced Research in Biotechnology, W. M. Keck Laboratory for Structural Biology, University of Maryland Biotechnology Institute. November, 2005