1 Przeciwciała, które można bezpiecznie i skutecznie stosować w terapiach ludzi Czy długotrwałą terapię można prowadzić wykorzystując przeciwciała zwierzęce?
2 Nie można stosować przeciwciał zwierzęcych w terapiach u ludziHAMA – human anti-mouse antibody Jakie mogą być skutki HAMA? Negatywne efekty ze strony układu odpornościowego włącznie z reakcjami alergicznymi (nawet szok anafilaktyczny). Osłabienie terapeutycznego efektu przeciwciał
3 CDRs – complementarity determining regionsRozwój technik genetyki molekularnej umożliwił tworzenie przeciwciał chimerycznych i humanizowanych Regiony zmienne CDR Mysie Humanizowane Chimeryczne Ludzkie CDRs – complementarity determining regions Bric.postech.ac.kr/.../2001/ _1.html
4 Czy reakcja układu odpornościowego będzie silniejsza przeciwko humanizowanym przeciwciałom niż całkowicie ludzkim przeciwciałom? Co to są przeciwciała antyidotypowe? Dlaczego dąży się do uzyskiwania całkowicie ludzkich przeciwciał?
5 Jak można uzyskać całkowicie ludzkie przeciwciała monoklonalne?wykorzystując myszy SCID (severe combined immunodeficiency) wykorzystując technikę immunizacji „in vitro” wykorzystując technikę ekspresji fagowej – ang. phage display wykorzystując myszy transgeniczne, u których geny kodujące mysie immunoglobuliny zastąpiono genami kodującymi ludzkie immunoglobuliny
6 SCID – severe combined immunodeficiency Próby uzyskiwania ludzkich przeciwciał monoklonalnych przy wykorzystaniu myszy SCID SCID – severe combined immunodeficiency ciężki, złożony niedobór immunologiczny SCID hu-hematochimeric mice Są to myszy, u których częściowo rekonstruuje się układ odpornościowy człowieka – transplantacja tkanek płodowych: fragmentów kości, grasicy, węzłów chłonnych. SCID u człowieka może wynikać z różnych mutacji. U myszy związany z mutacją w obszarze blisko centromeru chr. 16. Wystepuje tylko u homozygot W wyniku immunizacji dochodzi do aktywacji ludzkich komórek B i produkcji ludzkich przeciwciał. Stanowią dogodny model do badania chorób człowieka (nowotwory, zakażenia wirusowe np. HIV).
7 SCID nude brak B i T brak T (i sierści)SCID – mutacja w obrębie genu PRKDC (ang. protein kinase, DNA activated, catalytic polypeptide) biorącego udział w rekombinacji VDJ. Nude – mutacja w genie FOXN1. Brak rozwoju grasicy.
8 Uzyskiwanie ludzkich przeciwciał monoklonalnych technikąimmunizacji in vitro Idea: Jeśli umieścimy na szalce limfocyty ludzkie wyizolowane z krwi obwodowej i dodamy antygen, to limfocyty B specyficznie rozpoznające antygen ulegną aktywacji i zaczną produkować przeciwciała. Można je unieśmiertelnić wykorzystując wirus Epsteina-Barr (Michael Epstein i Yvonne Barr) Pierwszy problem: W takiej kokulturze komórki B bardzo szybko ulegały apoptozie. Stosowanie Leu-Leu-O-Me (ester metylowy leucylo-leucyny) prowadzi do apoptozy komórek NK i Tc, które przyczyniały się do śmierci komórek B. Drugi problem: albo nie udawało się w ogóle uzyskać komórek B produkujących przeciwciała, albo uzyskiwano komórki B produkujące IgM o niskim powinowactwie. Leu-Leu-O-Me trafia do lizosomów, gdzie jest przekształcany przez dipeptydazę peptydową I (katepsyna C) w związek membranolityczny. Różne typy komórek są w różnym stopniu wrażliwe na Leu-Leu-O-Me.
9 Cały czas próbuje się ulepszać proceduręWprowadzono dwie immunizacje: Prowadzi do powstania pierwotnej odpowiedzi (IgM) Prowadzi do dojrzewania limfocytów B (IgG, wyższa specyficzność) Do immunizacji stosuje się białko fuzyjne („nasz” Ag + powszechny epitop komórek T helper np. z toksyny tężca (TT)). W tej sytuacji komórki do immunizacji muszą pochodzić od jednej osoby, która wykazuje obecność komórek pamięci pomocniczych limfocytów T specyficznych dla epitopu TT.
10 Schemat procedury immunizacji in vitroPBMC: peripheral blood mononuclear cells: T (70%), B (15%), NK (10%), monocyty (5%), komórki dendrytyczne (<1%) TRF: T-cell replacing factor (CM z T-cell, stymulowanych mitogenem) k. żywiciele – naświetlane monocyty krwi obwodowej
11 Schemat drugiej immunizacji in vitroPo pierwszej immunizacji – tylko IgM Po drugiej immunizacji – przewaga IgM, ale pojawiają się IgG
12 Abgenix – biotechnologiczno-farmaceutyczna firma z KaliforniiUzyskiwanie ludzkich monoklonalnych przeciwciał z wykorzystaniem specjalnych myszy transgenicznych Są to myszy transgeniczne: z wyłączonymi genami kodującymi mysie immunoglobuliny z wstawionymi funkcjonalnymi genami kodującymi ludzkie immunoglobuliny Abgenix – biotechnologiczno-farmaceutyczna firma z Kalifornii Wyprowadzono szereg szczepów myszy (XenoMouse) produkujących ludzkie przeciwciała: IgG1k, IgG2k, IgG4k IgG1l, IgG2l, IgG4l Dwie inne firmy: w USA – Medarex (HuMab) i w Danii – Genmab (używa myszy HuMab)
13 1/16 F2 1/16 F2 IgH – obszar kodujący części zmienne i jedną z części stałych łańcucha ciężkiego (m, d i jeden z g).
14 Dlaczego wyprowadzono szczepy myszy z różnymi izotypami?YAC – sztuczny chromosom drożdżowy; zawiera 34 VH, wszystkie 23 DH i wszystkie 6 JH oraz Cm, Cd i jeden z Cg Dlaczego wyprowadzono szczepy myszy z różnymi izotypami?
15 IgG1 oraz IgG3 wiążą się z dużym powinowactwem do FcR makrofagów i komórek NKIgG1 oraz IgG3 aktywują dopełniacz IgG2 i IgG4 wiążą się z FcR z niskim powinowactwem. Nie aktywują dopełniacza. Jeśli chcemy aby nasze mAb rozpoznawały antygen na powierzchni komórek nowotworowych i prowadziły do ich eliminacji to wybierzemy myszy, które wykazują ekspresję ? Jeśli chcemy, aby nasze mAb np. blokowały jakiś receptor, ale nie były cytotoksyczne to wybierzemy myszy, które wykazują ekspresję......?
16 XenoMouse Immunizacja myszy prowadzi do stymulacji wzrostu komórek B produkujących specyficzne ludzkie przeciwciała. W celu uzyskania przeciwciał monoklonalnych można zastosować klasyczną fuzję z komórkami mysiego szpiczaka. Komórki hybrydoma będą produkowały ludzkie przeciwciała. Firma Abgenix opracowała także technikę – XenoMax (tajemnica firmy). Prawdopodobnie udoskonalono procedurę hodowli komórek B i unieśmiertelniania mysich komórek B (np. stosując wirus Epsteina-Barr).
17 ABX-EGF (panitumumab)blokuje receptor dla EGF (HER1) wykazujący nadekspresję w wielu typach nowotworów, np. płuc, piersi, nerki, pęcherza, jelita grubego. Pierwsze przeciwciało uzyskane metodą XenoMouse dopuszczone powszechnie do terapii przez Food and Drug Administration (FDA). Obecnie na rynku są już kolejne – Ustenkinumab (anty p40 IL12/IL23) i Denosumab (anty-RANKL). ABX-MA1 wiąże się z białkiem MUC18. Jest to białko adhezyjne wykazujące nadekspresję w komórkach czerniaka (melanoma), niektóyrch mięsakach, raku prostaty i układu moczowego. ABX-PTH wiąże i inaktywuje hormon przytarczyc (PTH). Ma znaleźć zastosowanie w terapii nadczynności przytarczyc, często związanej z chorobami nerek. Nadmiar PTH prowadzi do dekalcyfikacji kości.
18 Przeciwciała firmy Genmab:Nazwa Cel terapii HuMax-CD4 Zanolimumab chłoniaki HuMax-EGFR Nowotwory pochodzenia epitelialnego HuMax-HepC Wirus Hepatitis C HuMax-Inflam Anty-IL8 Różne choroby o podłożu zapalnym HuMax-TAC Odrzucanie przeszczepów AMG-714 (HuMax-IL15) Reumatoidalne zapalenie stawów Wszystkie są w różnych fazach prób klinicznych. Przeciwciała firmy Medarex: Nazwa Cel terapii Canakinumab Anty-IL1 Choroby autoimmunologiczne Golimumab Anty-TNF Chroniczne choroby o podłożu zapalnym
19 OKT3 Muronomab CD3 ReoPro Abciximab gpIIb/IIIa Rituxan Rituximab CD20Nazewnictwo przeciwciał terapeutycznych Nazwa handlowa Nazwa producenta Cel OKT3 Muronomab CD3 ReoPro Abciximab gpIIb/IIIa Rituxan Rituximab CD20 Simulect Basiliximab IL2Ra Zenapax Daclizumab IL2Ra Remicade Infliximab TNF Humira Adalimumab TNF Synagis Palivizumab wirus RSV Herceptin Trastuzumab HER2 Erbitux Cetuximab EGFR (HER1) Xolair Omalizumab IgE Avastin Bevacizumab VEGF
20 Nazewnictwo przeciwciał terapeutycznychomab mysie ximab chimeryczne zumab humanizowane umab ludzkie -ci tu lim lub - li vi
21 Uzyskiwanie fragmentów przeciwciał metodą ekspresji fagowej(phage display)
22 IDEA: Skonstruować bibliotekę zawierającą możliwie jak najwięcej (1 x 1011, przeciętne biblioteki mają > 1 x 108) cDNA kodujących przeciwciała. Mieć możliwość prostego i szybkiego wyszukania takich cDNA, które kodują białko rozpoznające nasz antygen. najwygodniej: opracować taką metodę, aby znajdując białko, które oddziałuje z naszym antygenem mieć „w garści” cDNA, który je koduje. Takie powiązanie genotypu z fenotypem jest możliwe dzięki ekspresji fagowej (ang. phage display)
23 Budowa faga filamentowego – M13
24 DNA faga koduje 11 białek gen białko (kDa) funkcja II X V VIII III VIXI 46,1 12,7 9,7 5,2 45,5 12,3 3,6 3,7 39,5 43,5 12,4 replikacja DNA wiązanie ssDNA główne białko kapsydu białko kapsydu składanie faga
25 Fagi filamentowe nie zabijają swoich gospodarzy, spowalniająCykl życiowy faga filamentowego Fag zakaża jedynie bakterie F+ poprzez oddziaływanie białka pIII z pilusem i białkami wewnętrznej błony bakterii – TolQ, R, A DNA wirusowe („+”) wnika do komórki bakteryjnej Nić komplementarna jest dobudowywana przez enzymy bakteryjne – tworzy się struktura dwuniciowa – RF DNA (replicative form). Nić komplementarna jest matrycą dla transkrypcji. Składanie faga – istotna sekwencja PS – packaging signal; Białko pVIII otacza DNA – im dłuższe DNA tym więcej cząsteczek białka pVIII. Fagi filamentowe nie zabijają swoich gospodarzy, spowalniają jedynie ich wzrost
26 Ekspresja z wykorzystaniem pVIIIfag typu 8 fag typu 88 Ekspresja z wykorzystaniem pIII fag typu 3 fag typu 33
27 Fagi 8 oraz 88 można wykorzystywaćdo ekspresji krótkich peptydów Fagi 3 oraz 33 – wykorzystuje się do ekspresji małych białek, ale często dochodzi do znacznego osłabienia infekcyjności faga
28 SYSTEM FAGEMIDOWY genom faga pomocniczego
29 System fagemidowy Składa się z: Wektora fagemidowego (np. pComb3H)Faga pomocniczego (zmodyfikowany fag filamentowy) Wektor fagemidowy to plazmid zawierający: plazmidowe ori (namnażanie dsDNA) fagowe ori (namnażanie ssDNA) sygnał pakowania marker oporności (inny niż zawarty w fagu pomocniczym) kasetę kodującą białko fuzyjne – fragment przeciwciała/pIII (biblioteka) Fag pomocniczy: fag filamentowy, którego genom charakteryzuje się: mutacją w ori (osłabienie replikacji) mutacją w sygnale pakowania (osłabione wykorzystanie DNA faga pomocniczego do składania faga) marker oporności (inny niż zawarty w fagemidzie)
30 Fag pomocniczy dostarcza wszystkich białek potrzebnych do namnażania fagemidu, pakowania fagemidu i białek otoczki fagemidu. W komórkach bakteryjnych zakażonych fagiem i stransformowanych fagemidem przede wszystkim do kapsydu pakowane jest DNA fagemidowe, gdyż DNA fagów słabo replikuje (osłabione ori) i w małym stopniu ulega pakowaniu (osłabiony sygnał pakowania).
31 Formaty bibliotek przeciwciałFab scFv 20 aa łącznik aa łącznik sprzyja tworzeniu sprzyja tworzeniu monomerów dimerów scFv = single chain variable fragments (pojedynczy łańcuch fragmentów zmiennych)
32
33 Kaseta ekspresyjna fagemidu pComb3HEkspresja Fab (RBS) Sfi I – rozpoznaje rzadką sekwencję: GGCCNNNNNGGCC
34 pIII SD – sekwencja Shine-Dalgarno = RBS PS – peptyd sygnałowy
35 Kaseta ekspresyjna fagemidu pComb3HEkspresja scFv
36 Typy bibliotek fagowych (fagemidowych)swoiste (immune) nieswoiste (naive) naturalne półsyntetyczne/syntetyczne
37 CDR1 CDR3 CDR2 V D J
38 Przygotowanie konstruktów genowychmetodą PCR
39 Amplifikacja fragmentów łańcuchówlekkich (wydłużanie komplementarnych końców) - miejsce restrykcyjne SfiI
40 Amplifikacja fragmentów łańcuchów ciężkichPCR I CH1
41 PCR III
42 Do amplifikacji fragmentów zmiennych wykorzystuje się cDNA uzyskane przez odwrotną transkrypcję RNA wyizolowanego z limfocytów krwi obwodowej albo ze szpiku kostnego. To RNA zawiera bardzo dużo rozmaitych sekwencji immunoglobulin Powiela się więc bardzo dużo rozmaitych sekwencji wykorzystując fakt, że sekwencje zrębowe Ig są podobne
43 Biblioteka naturalna (scFv)
44 Biblioteka semisyntetyczna
45 Biblioteka syntetyczna
46 Przygotowanie biblioteki fagemidowejPrzygotowanie elektrokompetentnych bakterii – E. coli - F+ Przygotowanie faga pomocniczego (namnożenie, oszacowanie ilości) Trawienie restryktazą Sfi I – zarówno DNA fagemidu pComb3H oraz produktów PCR Ligacja pComb3H z produktami PCR III Wprowadzenie fagemidów do bakterii – elektroporacja Zakażenie hodowli fagiem pomocniczym Hodowla bakterii w obecności antybiotyków (markery oporności faga i fagemidu) Izolacja fagów z supernatantu po hodowli bakterii (strącanie przy pomocy glikolu polietylenowego) MAMY GOTOWĄ BIBLIOTEKĘ FAGOWĄ
47 Gorączka Złota – USA, Kanada XIX w.PANNING
48 Selekcja fagów - panningProcedurę powtarza się wielokrotnie (3-6 razy), za każdym razem zwiększając ilość płukań: 5, 10, 15 razy.
49 Monitorowanie selekcji fagów
50 Dalsze etapy uzyskiwania fragmentówprzeciwciał izolacja pojedynczych klonów, amplifikacja, analiza synteza w E.coli z wykorzystaniem pComb3H, który zawiera sekwencje pozwalające na wykrywanie i oczyszczanie białka (fragment hemaglutyniny, His-tag) i który nie zawiera fragmentu białka pIII (uzyskuje się rozpuszczalne scFv). analiza sekwencji DNA ewentualnie: wklonowanie do eukariotycznego wektora ekspresyjnego – ekspresja w komórkach eukariotycznych dalsze modyfikacje z wykorzystaniem inżnierii genetycznej (mutacje punktowe, budowanie „całych” przeciwciał, dodawanie sekwencji liderowych itp).
51 Szczep E. coli TG1 nie rozpoznaje UAG jako stop.Wektor pIT2 pozwala na produkcję fagów prezentujących scFv oraz na produkcję rozpuszczalnych przeciwciał w zależności od szczepu bakterii wektor fagemidowy pIT2 M13 ori colE1 ori amp promotor lacZ scFv myc pIII RBS UAG Szczep E. coli TG1 nie rozpoznaje UAG jako stop.
52 Dojrzewanie przeciwciał można zastąpić przez „error-prone” PCRPo takim PCR uzyskuje się nową bibliotekę fagemidową, która będzie zawierała sekwencje kodujące scFv zarówno lepiej jak i gorzej dopasowane do Ag Powtarzamy selekcje