1 Przemysłowe wytwarzanie białekwytwarzanie przeciwciał hodowle komórek ssaków

2 Komórki uczestniczącew odpowiedzi immunologicznej

3 Mechanizm odpowiedzi immunologicznej typu humoralnego

4 Mechanizm odpowiedzi immunologicznej typu komórkowego

5 Rodzaje immunoglobulinInne rodzaje: IgD i IgE – wielkość jak IgG

6 Podstawowa struktura immunoglobuliny G (IgG)H – łańcuchy ciężkie; L – łańcuchy lekkie; Fab – region wiążący antygen; Fc – region krystalizowalny

7 Struktura immunoglobuliny typu GVH, VL – domeny zmienne; CH1, CH2, CH3 – domeny stałe

8 Obszary domen zmiennych IgGVH – region zmienny łańcucha ciężkiego; VL – region zmienny łańcucha lekkiego; CDR (complementarity determining regions) – trzy obszary determinujące komplementarność oddziaływania z antygenem; FR (framework regions) – cztery częściowo konserwatywne fragmenty w obszarze zmiennym

9 Funkcjonalne fragmenty molekuły IgG

10 Rekombinacja genów kodujących fragmenty łańcuchów Igw komórkach prekursorowych limfocytów B

11 Immunodiagnostyka Zasada trójetapowej proceduryELISA z wykorzystaniem dwóch przeciwciał

12 Immunocytochemia Zastosowanie chromogennych monoklonalnych przeciwciałdo różnicowego wybarwiania elementów komórek

13 Immunocytochemia Zastosowanie chromogennych monoklonalnychprzeciwciał do różnicowego wybarwiania elementów komórek. Analiza cyklu komórkowego

14 Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych przy użyciu komórek hybrydowych Zasada metody

15 Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych przy użyciukomórek hybrydowych

16 Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych przy użyciu komórek hybrydowych Produkcja przeciwciał przez zwierzęta immunizowane antygenem

17 Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych przy użyciu metody ekspozycji bibliotek fagowych Schemat otrzymywania biblioteki fagów prezentujących regiony zmienne ludzkich immunoglobulin

18 Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych przy użyciu metody ekspozycji bibliotek fagowych Zasada metody

19 Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych przy użyciu myszy transgenicznych Schemat otrzymywania myszy transgenicznych wytwarzających ludzkie przeciwciała

20 Przykłady biofarmaceutyków zawierających przeciwciała lub ich fragmenty Muromonab-CD3 Mysie przeciwciało monoklonalne wobec antygenu CD3 ludzkich komórek T. Wiąże się z glikoproteiną 20 kDa występująca na powierzchni limfocytów T. Zastosowanie: środek immunosupresyjny dla pacjentów po przeszczepach narządów. 2. Etanercept (Enbrel) Białko fuzyjne składające się z fragmentu wiążącego ligand pochodzącego z receptora ludzkiego czynnika matwicy nowotworu (TNFR), związanego z komponentem Fc ludzkiej IgG, zawierającego domeny CH2 i CH3 oraz region zawiasowy, ale nie domenę CH1. Wytwarzanie: komórki CHO w hodowli. Zastosowanie: Redukcja objawów ostrego reumatoidalnego zapalenia stawów. 3. Gentuzumab Ozogamicin (Mylotarg) Immunotoksyna. Połączenie rekombinowanej, humanizowanej IgG z cytoksycznym antybiotykiem przeciwnowotworowym, kalicheamycyną. Regiony stałe zawierają sekwencje ludzkie, natomiast regiony zmienne pochodzą z przeciwciała mysiego, rozpoznającego białko CD53. Zastosowanie: leczenie ostrej białaczki szpikowej CD53*.

21 Przykłady biofarmaceutyków zawierających przeciwciała lub ich fragmenty 4. Palivizumab (Synagis) Humanizowane przeciwciało monoklonalne IgG rozpoznające epitop we fragmencie atygenowym A białka F otoczki wirusa RSV. Sekwencja ludzka w 95% i mysia w 5%. Zastosowanie: leczenia ostrych infekcji dolnych dróg oddechowych u dzieci, wywołanych przez wirusa RSV. 5. ABCIXIMAB (ReoPro) Fragment Fab chimerycznego mysiego/ludzkiego przeciwciała rozpoznającego glikoproteine białka receptorowego na powierzchni ludzkich pytek krwi. Wytwarzane metod perfuzyjną w hodowli komórkowej. Zastosowanie: Lek zapobiegający tworzeniu skrzepów u pacjentów z niestabilną choroba wieńcową, u których przewiduje się wykonanie zabiegu operacyjnego w ciągu 24 h. 6. Ibritumomab Tiuxetan (Zevalin) Immunokoniugat mysiego przeciwciała rozpoznającego antygen CD20 na powierzchni zmienionych nowotworowo limfocytów B z tiuksetanem, selektywnym chelatorem Indu-111 oraz Itru-90. Wytwarzanie: komórki CHO. Zastosowanie: Leczenie niektórych typów białaczek. Lek jest podawany po uzupełnieniu o radioaktywne izotopy.

22 Hodowle tkankowe komórek ssaczychSchemat budowy komórki szpiczaka (myeloma cell)

23 Hodowle tkankowe komórek ssaczychSchemat procesu glikozylacji białek

24 Hodowle tkankowe komórek ssaczychPrzykładowe składy podłóż stosowanych do hodowli komórek ssaków

25 Hodowle tkankowe komórek ssaczychZmiana liczby komórek 0,2  106  1,5  106 Początkowe stężenia: Glukoza – 5-25 mM Glutamina – 2-6 mM Końcowe stężenia: Mleczan - ~ 1,7  pocz. st. Glc Alanina i NH mM Zmiany parametrów metabolicznych podczas hodowli komórek hybrydowych

26 Hodowle tkankowe komórek ssaczychSposoby prowadzenia hodowli komórek ssaków

27 Przykłady białek terapeutycznych produkowanych przy użyciu hodowli komórek ssaków Rodzaj białka Funkcja Typ glikozylacji Tkankowy aktywator plazminogenu czynnik fibrynolityczny N-gliko Erytropoetyna lek w przypadku anemii N- i O-gliko Czynniki VII, VIII, IX i X lek w przypadku hemofilii N- i O-gliko Interleukina 2 przeciwnowotworowy immunostymulujący, anty-HIV O-gliko Interferon  przeciwnowotworowy N- i O-gliko Interferon  i  przeciwnowotworowy immunostymul., antywirusowy N-gliko G-SCF przeciwnowotworowy O-gliko Przeciwciała monoklonalne Terapia i diagnostyka N-gliko