1 Qué es apoptosis ?¿ (Kerr, 1972)Es una forma de muerte celular Cumple un rol crítico en el desarrollo Anomalías pueden producir cáncer y autoinmunidad La señalización ocurre por medio de múltiples vías (dos vías principales: mediada por la mitocondria y mediada por los receptores de muerte) Todas las vías convergen a un único sistema de proteasas efectoras (CASPASAS)

2 procesos apoptóticos ?¿Donde podemos ver procesos apoptóticos ?¿ Desarrollo embrionario Homeostasis Celular Inmunología Enfermedades Virales Enfermedades neurodegenerativas

3 Diferencias entre apoptosis y necrosisEfecto de burbujas en la membrana Encogimiento de la célula Aparición de cuerpos apoptóticos Requiere ATP No ocurre a 4ºC Fragmentación del ADN (Ladder) Puede morir una única célula No inflamación Necrosis Perdida de la integridad de la membrana La célula se hincha No hay formación de ´vesículas No se requiere energía Puede ocurrir a 4ºC Digestión al azar del ADN Mueren grupos de células Procesos inflamatorios presentes

4 Características generales de la ApoptosisCondensación de la cromatina y encogimiento celular Activación de receptores de Muerte Dimerización de miembros de la familia de bcl-2 Se hincha la membrana externa de la mitocondria, produciendo la liberación de citocromo c Activación de caspasas Activación de DNAsas Translocación de Fosfatidilserina Dependencia de ATP Fragmentación del ADN (“Ladder”)

5 CASPASAS Las caspasas son cisteín-proteasas y clivan sustratos después de un Asp. Existen muchas y la especificidad esta dada por los 4 residuos anteriores al sitio de corte. Son sintetizadas en forma de procaspasas inactivas, pudiendose autoactivar clivandose ellas mismas. Clivan e inactivan las enzimas de los sistemas reparadores del ADN. Caspase-1 (ICE) Caspase-2 (ICH-1, Nedd-2) Caspase-3 (CPP32, Apopain, Yama) Caspase-4 (ICH-2, TX, ICEreıı) Caspase-5 (ICErelııı, TY) Caspase-6 (Mch2) Caspase-7 (ICE-LAP3, Mch3, CMH-1) Caspase-8 (FLICE, Mch5, MACH) Caspace-9 (Mch6, ICE-LAP6) Caspase-10 (Mch4)

6 Proceso Apoptótico Inducción Moduladores Efectores Sustratos MUERTEDeprivacion de factores de crecimiento Hipoxia Pérdida de adhesión Activación de receptores de muerte Radiación Inducción química CASPASAS FADD TRADD FLIP Bcl-2 Citochromo c p53 Mdm2 Varias proteínas celulares ADN

7 Células apoptóticas en cultivoNormal Con burbujas Con puntas Ampolla

8 Células apoptóticas Necrosis Apoptosis

9 Células apoptóticas

10 Detección de apoptosisAnálisis de ADN (Gel de agarosa) Marcado de los extremos del ADN fragmentado Tinción de la fosfatidilserina expuesta y posterior cuantificación de las células positivas Microscopía en tiempo real (Video) Citometría de flujo Morfología (Tinción con colorante de Hoechst) Microscopía electrónica

11 Análisis de ADN (Gel de agarosa)Gel de agarosa de 2 % Tinción con bromuro de etidio, SYBR-Green, SYBR-Orange, Real-Blue, Desarrollo electroforético: Voltage constante (100V) y tiempo 1:40 hs Por ser un desarrollo electroforético de larga duración, asegurarse de mantener las condiciones refrigerantes adecuadas

12 Visualización de productos de ADN

13 “Ladder” (Escalera de ADN fragmentado)

14 Problemas con el “Ladder”

15 Software Hardware Programas del paquete Image Gauge de FujifilmPrograma del paquete Digital Science y Science Lab de Kodak ImageQuant, ImageMaster y ArrayVision Software de AmershamBiosceinces Hardware Cámaras digitales de 5 a 12 MegaPixels Transiluminadores potenciados con luz UV de (270 y 305 nm)