1 “Quenching” de fluorescenciaquenching = desactivación= apagamiento = menor emisión IF (Q) < IF (-Q) Reacciones en el estado excitado (Quenching colisional) Entrecuzamiento intersistema a estado Triplete Rearreglos moleculares Transferencia de energía Transferencia de carga Formación de complejo en el estado basal (Quenching estático)

2 Mecanismos de desactivación bimolecularQuenching colisional Transferencia de energía Transferencia de carga Reacción F Q P * + -

3 Quenching colisional o dinámicoX X* hν hν’  < 0 Q XQ* X + Q kQ 0  / 0 = F/F0

4 Quenching colisional o dinámicoA una concentración fija del fluoróforo, medimos cómo varía la fluorescencia con concentraciones crecientes de quencher y se calcula: F0/F (F0: fluorescencia en ausencia de quencher) Gráfico de Stern-Volmer F0/F = 1 + Ksv [Q] F0/F [Q] 1 Ksv Ksv = constante de Stern-Volmer, depende de: • tipo de fluoróforo y quencher • accesibilidad del fluoróforo (viscosidad,temperatura)

5 Quenching colisional o dinámicoStern-Volmer F0/F

6 Quenching de triptofano por O2KSV = 32 M-1

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8 Quenching colisional o dinámicoKSV = kq 0 kq = cte. vel. quenching k0 = cte. vel. colisional (controlada por difusión) fQ = fracción de encuentros efectivos que terminan en quenching kQ se determina experimentalmente a partir de KSV. Se estima la eficiencia de quenching fQ calculando k0 según Smoluchowski: O se conoce la eficiencia de quenching fQ entonces se calcula k0 para estimar el coeficiente de difusión D usando la ecuación de Stokes-Einstein:

9 Quenching dinámico o colisionalSe requiere contacto entre Q y F, interacción molecular Quenching dinámico o colisional: Q + F* Q debe difundir hacia F distancias moderadas (a diferencia de relajación por solvente) Indica localización del F, exposición de F de manera de ser accesible a Q

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11 Colicin E1 = proteina de membrana12 W

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13 Quenchers of W emission: Iodide, acrylamide, disulfide, e-defficient groups like–NH3+, -COOH, histidine protonated

14 Carga del quencher afecta el quenching (Ksv)

15 Impedimento estérico disminuye quenching (Ksv)DHE = dihidroequinelin = esteroide fluorescente SBP = steroid binding protein

16 Transferencia de energíah n1 h n2 h n Donante Aceptor FRET Cuando una molécula del donante absorbe un fotón y hay una molécula de aceptor cerca, puede ocurrir la transferencia de energía del estado excitado del donante al aceptor por una via no radiativa. Como resultado de la transferencia de energía se observa una disminución en la intensidad de fluorescencia emitida por el donante y, si el aceptor es fluorescente, la aparición de una nueva señal fluorescente.

17 * * RESONANCE ENERGY TRANSFER (RET o FRET): F D A A A D EX D EM DEX A A EM A A A * D

18 Solapamiento espectralDonante Aceptor Solapamiento Absorbancia Fluorescencia

19 La eficiencia de la transferencia depende de:• la distancia entre D y A • el grado de solapamiento entre el espectro de emisión de D y el de absorción de A • la orientación relativa entre D y A • el tiempo de vida de D*

20 Eficiencia de la transferencia de energíaExperimentalmente, E puede calcularse a partir de los tiempos de vida o intensidades de fluorescencia del donante en ausencia y presencia del aceptor.

21 Eficiencia de la transferencia de energíak J N r TE d, a d = × 9000 10 128 2 4 5 6 ln Q h p t R J N o d a 6 5 9000 10 128 2 4 = × ln k Q h p

22 Dependencia con la distancia0.25 0.5 0.75 1 20 40 60 80 100 Distance in Angstrom Efficiency of transfer Se pueden medir distancias por FRET entre ~0.5 R0 and ~1.5R0 Donante Aceptor Ro (Å) Fluoresceina Tetrametilrodamine 55 IAEDANS Fluoresceina 46 Fluoresceina Fluoresceina 44 BODIPY FL BODIPY FL 57

23 ¿Para que sirve? F • para medir distancia inter o intramoleculares.Con esa informacion se puede: -estudiar cambios conformacionales -medir asociaciones - colocalizar in vivo etc,etc EM A EX D F • se puede ver la disminución de la fluorescencia de D o el aumento de la emisión de A. En general se usa la primera forma.

24 Hidrólisis de un sustrato

25 FRET TIBS (2000) 25;

26 Eficiencia FRET Dador (λexc 1, λem1) Uso λexc 1 y λem2Aceptor (λexc 2, λem2) Eficiencia FRET, E = 1 – F (D+A)/FD E = Ro6/ Ro6 + r6 Ro = radio Forster, r = distancia entre D y A

27 Formación de agregados moleculares

28 Usos de fluorescencia en bioquímicaLocalización subcelular Cambios en la concentración Interacciones moleculares Cambios conformacionales Distancias intra/intermoleculares Difusión rotacional Caracterización estructural Actividad enzimática ●●●