1 Real Time qPCR en la mesadaProblemas, más y más problemas…. Feliz día a todas las mujeres!

2 Extracción de RNA

3 Material de partida

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5 Tubos AXYGEN

6 Buffer TAE nuevo, Más tiempo NaOH H2O nueva (prep muestras) Loading buffer EtBr

7 Consideraciones para chequear integridad del ARN en gel de agarosaTratar cuba electroforética con NaOH 0.5 M por ½ - 1 hora Usar agua estéril para preparación de buffer NO reutilizar el buffer Separar reactivos exclusivamente para RNA (agarosa, EtBr, Loading Buffer) Correr poco tiempo (ej: 15 min a 100 V) Siempre usar agua miliQ para preparar muestras

8 Particularidades… Hígado: - centrifugación luego del TriZol - doble extracción con cloroformo Sangre: - menor volumen de resuspensión (10 – 20 ul) - GlycoBlue

9 qPCR

10 ¿¿ Cq > 32/33 ?? SD - RNA realmente íntegro?Degradación post-extracción? Problema en la qPCR Control + !! - Problema en la RT Enzimas? Pre-amplificación Gen de baja expresión? Cambiar de gen !!

11 Nueva tanda de cDNA CHEQUEAR ! Con 1, 2 o 3 cDNAs Pool de cDNAs

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13 Lámpara de excitación? SYBR??

14 SYBR Estabilidad Inhibición

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17 AMPLIFICA EL NTC !!! Dímeros de primer ?? Contaminación ??

18 Dímeros de primer - Diseñar nuevos - T annealing - Cc usada

19 Contaminación

20 Lidiando con las contaminaciones…Juego de pipetas exclusivo NEVER IN THE LIFE sembrar los productos de PCR con esas pipetas Gel agarosa en sala aparte No mezclar por pipeteo Alicuotar reactivos Stock de primers: tips con filtro, alicuotar!! Hacer SIEMPRE blanco de reacción (NTC) para cada gen

21 Construyendo una Curva Standard…

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23 Curva Standard Ef = 10 ^ - (1/Pend)

24 Puntos a tener en cuenta…cDNA a utilizar Temperatura de annealing (1,6  1,9) Puntos de la curva!!! muy concentrados: se va de la linealidad NO incluir diluciones 1/10 – 1/20 muy diluidos: dispersión de los datos / problemas con blancos!!

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27 Persevera….. ….. Y triunfarás!!