1 Regulacja ekspresji transgenu w roślinachAnna Śledzińska Ewa Skotnicka

2 Części składowe transgenupromotor podstawowy TATA box sekwencja Inr element dpe (downstream promoter element) wzmacniacze (enhancer) wyciszacze (silencer) sekwencja liderowa (5’UTR) wzmacniacze translacji np. z wirusa AMV sekwencja Kozak – 5’-ACCAUGG-3’ , zawiera kodon inicjacji translacji

3 Części składowe transgenu c.d.n.wprowadzony gen miejsce poliadenylacji w regionie 3’UTR (często pochodzi z genu syntazy oktopiny) – oddziaływuje z regionem 5’UTR podczas inicjacji translacji

4 „Transgene expression and control” B„Transgene expression and control” B. Miki Eastern Cereal and Oil Research Center

5 Najczęściej stosowane promotoryPromotory genów konstytutywnych CaMV 35 S nos ocs Promotory enzymów tkankowo specyficznych fazeoliny gluteniny α-amylazy Pochodzenie Wirus mozaiki kalafiora Syntaza nopaliny (T-DNA) Syntaza oktopiny (T-DNA) Miejsce ekspresji genu liścienie bielmo warstwa aleuronowa

6 Rośliny zakażone wirusem mozaiki kalafiorowejSource: Institut National de la echerche Agronomique, Versailles-Grignon

7 Zwiększanie ekspresji transgenuusunięcie kryptycznych miejsc dla splicingu mRNA i poliadenylacji z regionu kodującego (dotyczy najczęściej genów bakteryjnych) miejsca te powodują zbyt szybkie zakończenie translacji i powstawanie skróconych białek modyfikacja sekwencji w celu eliminacji rzadkich dla rośliny kodonów wprowadzenie intronów do sekencji 5’UTR powoduje znaczące zwiekszenie ekspresji transgenu – mechanizm słabo poznany

8 Zwiększanie ekspresji transgenu c.d.n.umieszczenie wzmacniacza GAL4 z drożdży przed promotorem powoduje powstanie nowego miejsca oddziaływania ze sztucznymi czynnikami transkrypcji (domena wiążąca DNA z GAL 4, a domena aktywatorowa z roślinnych czynników transkrypcyjnych) np. podobną metodę zastosowano do uzyskania transgenicznego ryżu tworzenie mieszanych promotorów w przypadku promotora 35S duplikacja całej sekwencji promotora lub wielokrotne powtórzenie sekwencji dystalnej w promotorze zwiększa poziom ekspresji

9 Charakterystyczne cechy regulacji transkrypcji u roślinTranskrypcja regulowana u roślin jest bardzo specyficzna w stosunku do danego gatunku i danego typu komórek np.u Arabidopsis odkryto 2 – 3 razy więcej genów kodujących czynniki transkrypcyjne niż u Drosophila czy Caenorhabditis elegans W roślinach nie opisano dotychczas wzmacniaczy o tak dalekim zasięgu jakie spotykamy u ssaków Nie występują również wzmacniacze oddziaływujące z pozycji trans

10 Geny kryptyczne elementy regulatorowe, które w swoim oryginalnym położeniu są nieaktywne, po zmianie położenia wykazują aktywność istnieją we wszystkich organizmach jako promotory, wzmacniacze transkrypcji i translacji oraz sygnały poliadenylacji i miejsca splicingu regulują ekspresję konstytutywną i komórkowo specyficzną są bardzo liczne w genomie i tworzą zbiornik elementów regulatorowych, które mogą być nabyte przez geny

11 Geny kryptyczne c.d.n. zmiana ich miejsca połżenia może zachodzić na skutek niesymetrycznego crossing over, a także poprzez transpozony

12 Remodelowanie chromatynyw procesie tym biorą udział kompleksy remodelujące chromatynę CRM oddziałujące z ogonkami histonów powodując niewielkie zmiany w strukturze nukleosomów, co umożliwia ich przemieszczanie w efekcie pozwala to na wiązanie się do DNA białek biorących udział w ekspresji genów

13 Remodelowanie chromatyny c.d.n.promotor genu fazeoliny (białko zapasowe występujące w liścieniach fasoli) jest indukowalny ABA w nasionach, natomiast wprowadzony do liści transgenicznego tytoniu nie wykazuje aktywności. Powodem tego był brak w liściach czynnika PvALF (powoduje zmiany w konformacji chromatyny umożliwiające przyłączenie się czynnika transkrypcyjnego TFIID do promotora) przy stałej ekspresji PvALF w liściach transgenicznego tytoniu promotor fazeoliny staje się aktywny i indukowalny ABA

14 Acetylacja histonów acetylacja ogonków histonów (zasadowe fragmenty N-końcowe) katalizowana przez acetylotransferazy histonów osłabia oddziaływanie DNA z histonami deacetylacja przeprowadzana przez deacetylazy (HDACs) wzmacnia te oddziaływania badania na mutancie Arabidopsis PICKLE z mutacją w HDAC wykazały brak zahamowania ekspresji genów embrionalanych, co uniemożliwiło dalszy rozwój zarodka

15 Metylacja histonów związana ze zmniejszaniem stopnia acetylacji histonów i dlatego indukuje powstawanie bardziej upakowanych struktur chromatyny w metylowanych rejonach chromosomowego DNA mechanizm wyciszania genów poprzez metylacje DNA nie jest u roślin dokładnie poznany

16 poznanie molekularnych mechanizmów ekspresji genów pozwala na wydajniejsze konstruowanie roślin transgenicznych ułatwia zrozumienie procesów metabolicznych zachodzących w roślinie