1 Reparación del DNA

2 Daño al DNA puede ocasionar mutacionesLos daños en el DNA son minimizados por sistemas que los reconocen y corrigen Daño al DNA SISTEMA DE REPARACIÓN EXITOSO Sin consecuencias Daño al DNA SISTEMA DE REPARACIÓN X MUTACIÓN

3 Daños espontáneos al DNASitios AP al día inestable 100 al día

4 Desaminación: pueden generar “hot spots”C-G T-A

5 Tautómeros

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7 Daños inducidos al DNA La metil guanosina se aparea de formaincorrecta con la timina causando un cambio de G-C a T-A Radiaciones ionizantes: rayos X pueden causar rompimiento en el DNA

8 MECANISMOS DE REPARACION1- Sistemas de Reparación directos Enzimas que revierten directamente el daño. Por estos mecanismos se reparan: metilación de guanina, y en algunos vertebrados dímeros de pirimidína. No intervienen nucleasas ni ADN-polimerasas. Fotoreactivación (ruptura de los dímeros de pirimidinas por acción de una fotoliasa (phr) activada mediante luz visible).

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10 Reparación Fotoreactivación

11 Desmetilación

12 2- Sistemas de Reparación IndirectaHay intervención de nucleasas y ADN-polimerasas. Se necesita de la hebra “molde” perteneciente al mismo cromosoma o al homólogo. Reparación por Escisión (BER , NER, MMR) Reparación de nucleótidos (NER) aislados por lesión UV: necesita la otra hebra como templado (hasta 30 bp). Intervienen las endonucleasas uvrA,B,C y la helicasa uvrD. Además de foto productos, repara lesiones voluminosas (bulky) que distorsionan la conformación del dúplex y que obstaculizarían la transcripción y replicación. Reparación de bases modificadas (BER).- Repara casos de alteraciones puntuales en bases nitrogenadas (lesiones NO voluminosas) producidas por alquilación, oxidación o desaminación. Se origina un “sitio AP” y luego se retira el nucleótido “AP” y se re sintetiza la hebra)

13 2) Reparación Indrecta de Daño al DNAReparación por escisión de Bases (BER) 1) Iniciado por DNA glicosilasa específica reconoce el daño, corta la unión glicosílica entre base y azúcar y se forma el sitio AP 2) Sitio AP reconocido por AP endonucleasa (corte 5’ de AP). 3) Fosfodiesterasa (corte 3’). 4) DNA polimerasa rellena el gap DNApol I (E.coli), DNA pol  (mamíferos). 5) DNA ligasa 2) Reparación Indrecta de Daño al DNA

14 Reparación por escisión de Nucleótidos (NER)Escinucleasa uvrABC realiza este tipo de reparación en dímeros de timina, otros fotoproductos y bases dañadas. Escinucleasa (246 kDa) está compuesta por tres subunidades (A, B y C) UvrA (dímero con actividad de ATPasa) se une al DNA en la región dañada. UvrB/UvrC tienen actividad de endonucleasa y corta en los lados adyacentes de la cadena liberando un oligonucleótido La región “vacía” es rellenada por una DNA polimerasa I y sellada por una DNA ligasa. UvrD E.coliSistema Uvr ABC: Remoción de 12nt EucariontesRemoción de nt

15  Reparación post- replicativaReparación del apareamiento (MMR) (“mismatch repair”): Su principal tarea es remover bases mal aparadas y pequeños “loops” introducidos por inserciones / deleciones durante la replicación Reduce los errores de replicación de 10-7 a pb / replicación

16 Reparación de bases mal apareadas(MMR)E.coli genes mut S, L, H Reemplaza hasta 1kb Metilación diferencial (dam, dcm) MutS reconoce el mismatch MutH distingue ambas cadenas Corte en GATC en la cadena no metilada Mut L coordina actividad de Mut S y H En eucariotas homólogos de proteínas Mut

17 … Reparación post- replicativaRecombinación Homóloga (HR) Reparación de ambas cadenas Usa ADN homólogo como templado y es altamente exacto Más activo durante la Fase S y G2 Unión de extremos no homólogos (NHEJ) No usa ADN templado y generalmente se pierden algunos nucleótidos. Más activo en la Fase G1

18 Mecanismos de reparación cuando las dos cadenas se dañan

19 NHEJ en bacterias

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21 NHEJ en bacterias

22 polIV Respuesta SOS polII Pol V

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24 Mecanismos de Reparación en Eucariontes

25 Mecanismos de reparación en Eucariontes (NER)Participan > de 25 proteínas Reconoce el daño 3 síndromes XP-B XP-D Helicasas que forman parte de TFIIH Abre las cadenas XP-A confirma la presencia del daño XP-G; XP-F endonucleasas Corrige el error

26 XPA-XPG CSA y CSB

27 ATM: vía de transducción de señales

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29 Recombinación homóloga Recombinación no homóloga

30 Recombinación homólogaRecombinación entre cromátidas hermanas Recombinación entre cromosomas homólogos

31 El modelo Holliday (a) pair of chromatids(b) a single strand cut is made in each chromatid (c) strand exchange takes place between the chromatids (d) ligation occurs yielding two completely intact DNA molecules

32 Uniones Holliday

33 Uniones Holliday

34 Resolución de las uniones HollidayHolliday junction

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36 El modelo de Holliday explica la conversión genética

37 El modelo Meselson-Radding

38 El modelo de Meselson-Radding

39 El modelo de la cadena doblefragmentada

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42 Vía RecBCD Subsequently, it was shown that mutations that inactivate the recB or recC gene lead to defects in conjugational, transductional, and phage recombination; a loss of SOS induction; sensitivity to DNA-damaging agents that cause DSBs; and low cell viability as being a physical component of the “RecBC” holoenzyme required for the exonuclease activity (7, 37, 105, 178). This late discovery was, in part, due to the complexity of interpreting the recD phenotype. In contrast to the recB and recC phenotypes, recD cells are fully viable, are resistant to DNA-damaging agents, and display hyperrecombinogenic behavior

43 Secuencia Chi Estimula la recombinación en forma direccional5´-GCTGGTGG-3´ Octámero sobre-representado en el genoma de E. coli. Existen aprox 1,008 sitios Chi. Aparecen en promedio cada 4.5 kpb. 75% de los sitios Chi están orientados hacia el origen de la replicación

44 RecBCD 134 kDa 129 kDa Rec B es una ATPasa dependiente de DNAy una helicasa que opera en direccion 3´--5´. Rec B interacciona con RecC para formar una helicasa rapida y procesiva. El dominio de nucleasa puede funcionar como endo o exo. Este dominio interacciona con RecA. Existe muy poco trabajo bioquimico sobre RecC. Sola no tiene ninguna actividad pero unida a RecB estimula la actividad de ATPasa y helicasa. Mutantes en RecC alteran el reconocimiento de la secuencia Chi. RecD ha sido dificil de estudiar porque se purifica de manera insoluble y la que es soluble no tiene actividad. Experimentos renaturalizando la proteína muestran que tiene una actividad de ATPasa dependiente de DNA de cadena sencilla y una actividad de helicasa 5´---3´. 67 kDa

45 Translocación bipolarRecD RecB Inactivacion de cualquiera de las dos helicasas, disminuyen la velocidad de desenrrollamiento entre 2 y 3 veces. = velocidad ≠ velocidad

46 3´ Vía RecBCD 5´ Ocasionalmente + frecuente

47 Vía RecBCD

48 Proteína RecA 37kDa Aprox 8,000 a 10,000 Aumenta a 70,000 en SOS3 nucleótidos/monómero que se extiende en dirección 5´--3´

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50 Enzimas bacterianas que catalizan la recombinaciónRecA Intercambio de cadenas de DNA RuvA, B Migración de los entrecruces. RuvA es tetramérica y tiene alta afinidad por HJ independiente de la secuencia. RuvB es hexamérica y tiene afinidad por DNA. Tiene actividad de ATPasa que es estimulada por unión a RuvA. RuvC Nucleasa resuelve entrecruzamientos

51 Proteínas RuvA,RuvB

52 Resolvasa RuvC Homodímero de 19kDa

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54 Reparación por recombinación

55 Reparación post-replicativa