1 RNA i transkrypcja u eukariontów

2 Rodzaje sekwencji w DNA (sekwencje kodujące w genomie człowieka – 0,015% (+niekodujące sekwencje regulatorowe – promotory/enhancery/izolatory) Single copy genes Kodujące

3 Rozmieszczenie sekwencji w chromosomachKonstytutywna heterochro- matyna

4 Rozproszone rodziny genoweLudzkie geny globinowe typu α i β Ψ - pseudogeny ξ,ε,γ -globiny płodowe

5 Zwarte rodziny genowe Geny kodujące histony w genomie Drosophilaa, b, c, d, e – krótkie sekwencje rozdzielajace poszczególne geny

6 Geny nieciągłe Sens biologiczny intronów?Początek pierwszego eksonu (5’ koniec mRNA) Kraniec ostatniego eksonu (3’ koniec mRNA) Zawartość genów nieciągłych: Drożdże – 5% (ale 26% wszystkich transkryptów) Rośliny i zwierzęta – większość genów ( ≥ 85%) Sens biologiczny intronów? 60% genów ludzkich – alternatywny splicing Gen Dystrofiny (dystrofia mięśniowa Duchenne’a) – 75 intronów 2,5 mln pz.; Eksony – pz. (0,5% genu) Długość intronów: 31 pz (SV-40) – pz (Dystrofina)

7 Transkrypcja w komórce eukariotycznejTranskrypt – kopia nici matrycowej DNA o sekwencji Identycznej z sekwencją nici kodującej DNA Trzy fazy transkrypcji: inicjacja, elongacja, terminacja Podstawowe elementy systemu transkrypcji: polimerazy RNA czynniki transkrypcyjne sekwencje regulatorowe w DNA

8 Bakteryjna polimeraza RNABiałko o masie ok.480 kd Cztery podjednostki: alfa (α), beta (β), beta’ (β‘) i sigma (δ); tylko pierwsze trzy niezbędne do aktywności enzymatycznej (rdzeń polimerazy) Czynnik sigma niezbędny dla wiązania RNA polimerazy do promotora; enzym ma ogólne powinowactwo do DNA, w obecności czynnika sigma wiąże się jednak wyłącznie do promotora.

9 Eukariotyczna Polimeraza RNACztery typy Mitochondrialna – 1 (u roślin także – chloroplastowa) Jądrowe: - 3 Typ Produkt Lokalizacja Budowa α-amanityna RNA Polymerase I rRNA jąderko Podjedn Niewrażliwa RNA Polymerase II hnRNA nukleoplazma Podjedn. B. wrażliwa snRNA (splicing) RNA Polymerase III tRNA nukleoplazma Podjedn. Umiark. wrażliwa 5S rRNA Masa Pol II ponad 500 kd Dwie duże podjednostki; ok. 10 małych podjednostek; największa podjednostka: homologiczna do β', następna co do wielkości – do β. Dla wiązania się z DNA potrzeba wielu czynników nie należących do kompleksu polimerazy

10 Polimerazy RNA Prokarionty Eukarionty Homlogi Homologi

11 Transkrypcja u bakterii - inicjacja

12 Transkrypcja u bakterii - elongacja

13 Promotor u prokariontów

14 Sekwencje regulatorowe Pol IIEukarionty

15 Sekwencje regulatorowe Pol I i Pol IIIPol I – promotor dwuskładnikowy -107 do -180 -45 do +20 Pol III – dwa typy promotorów Zewnętrzny (zawiera TATA) Wewnętrzny +55 do +80 5s rRNA snRNA

16 Składniki kompleksu transkrypcyjnegoA) Ogólne Czynniki Transkrypcyjne (GTF) – takie same dla wszystkich genów transkrybowanych przez daną polimerazę RNA - wraz z polimerazą stanowią tzw. „Podstawowy Aparat Transkrypcyjny”, wiążą się do sekwencji w obrębie bliskiego promotora i miejsca startu transkrypcji. B) Aktywatory – Czynniki Transkrypcyjne (TF) oddziałujące bezpośrednio z DNA, wiążą się do sekwencji dalszego promotora i sekwencji w enhancerach. C) Koaktywatory i Korepresory – białka nie oddziałujące bezpośrednio z DNA, stanowią ogniwo pośrednie umożliwiające oddziaływania między TF związanymi z dalszym promotorem i enhancerami a Podstawowym Aparatem Transkrypcyjnym.

17 Porównanie inicjacji transkrypcji u pro- i eukariontów

18 Sekwencje w promotorze Pol II

19 Czynnik transkrypcyjny AP1 ma domenę z motywem suwaka leucynowego

20 Suwak leucynowy

21 Czynnik transkrypcyjny Sp1 ma domenę z motywem palców cynkowych

22 Motyw palców cynkowych

23 Czynniki transkrypcyjne z motywem H-T-H (Helix-Turn-Helix)

24 Oddziaływanie z DNA warunkuje interakcje

25 Inicjacja transkrypcji Pol IITFIID

26 Inicjacja transkrypcji Pol II- budowa TFIIDTBP – TATA-Binding Protein TAF - TBP-Associated Factors GTF – General Transcription Factor

27 Działanie enhancerów

28 Drożdżowy system dwuhybrydowy

29 Enhancery działają na odległość

30 Funkcja i rozmieszczenie izolatorów

31 Komplikowanie się obrazu transkrypcji Pol II

32 Szczeble regulacji transkrypcji

33 Dodawanie czapeczki na 5’ końcu transkryptu

34 Sekwencje rozpoznawane przez system splicingu

35 Mechanizm splicingu

36 Splicing alternatywny

37 Poliadenylacja 3’ końca mRNA

38 Struktura 3’ szpilki w mRNA histonów

39 NMD- Nonsense-Mediated Decay System degradacji nieprawidłowych mRNA, zawierających PTC (Premature Terminantion Codon) - przedwczesne kodony terminacyjne translacji Ścieżka NMD wywiera bezpośredni wpływ na setki zaburzeń genetycznych w populacji ludzkiej. ¼ wszystkich znanych mutacji u człowieka indukuje NMD