1 Rozpraszanie światła

2 Światło fala elektromagnetyczna o długości z zakresu widzialnego ( nm) strumień fotonów

3 Natura falowa światła Ez(t)=Eosin(2πυt-ky) Hx(t)=Hosin(2πυt-ky)Eo,Ho - amplitudy υ - częstotliwość k=(2π/λ)=ω/c - wektor falowy w kierunku rozchodzenia się fali ω=2πυ=2πc/ λ - częstość kątowa

4 Natura falowa światła w liczbach: prędkość światła c = 2,9979×108m/sdługość fali λ = ( )nm (1 nm = 10-9m = 10 Å) częstotliwość υ = (7,7 - 3,8)×1014 Hz (fioletowe-czerwone) liczba falowa (częstość υ = 1/λ) cm-1 rozmiar cząsteczek rozpraszających: Å ( nm)

5 Natura korpuskularna światłapromieniowanie EM jest strumieniem fotonów E=hν=hνc, energia fotonu o częstotliwości ν Hemoglobina ma kolor czerwony! - silnie absorbuje promieniowanie żółte, zielone i niebieskie a przepuszcza czerwone Zaabsorbowany foton odpowiadający światłu żółtemu (λ=550nm) to energia 3,61×10-19J

6 Rozpraszanie światła Prawo elektrodynamiki klasycznej: drgający ładunek jest źródłem promieniowania rozchodzącego się we wszystkich kierunkach w płaszczyźnie prostopadłej do oscylacji Cechy: częstość i intensywność

7 Cechy promieniowania rozproszonegoIntensywność (natężenie), I ~ Eo2 (kwadrat amplitudy pola elektrycznego) I ~ λ-4 (fale krótsze rozpraszają się silniej niż dłuższe) I zależy od kąta rozpraszania θ Częstość: równa częstości promieniowania padającego = rozpraszanie Rayleigha (1871r.) = elastyczne różna od częstości promieniowania padającego = rozpraszanie Ramana (1928r.) = nieelastyczne

8 Dlaczego niebo jest niebieskie?

9 Dlaczego niebo jest niebieskie!(700 nm / 400 nm)4 = = 9.4 Światło czerwone rozprasza się nawet 9-krotnie słabiej niż fioletowe.

10 Rozpraszanie w roztworzev-mikroskopijnie mały element objętości zawierający molekuły rozpraszające światło, ki , ks – wektory falowe światła padającego i rozproszonego. q- wektor rozpraszania, P- punkt obserwacji natężenia pola elektrycznego Es, odległy o R od środka układu rozpraszającego, W elastycznym rozpraszaniu światła, ki i ks są sobie równe, |q| = |ki ­ ks| = 4n/sin(/2).

11 Częstotliwość światła rozproszonegorówna częstotliwości promieniowania padającego = (rozpraszanie Rayleigha) = elastyczne oddziaływanie pola fali EM z dipolem elektrycznym cząsteczki różna od częstotliwości promieniowania padającego = (rozpraszanie Ramana) = nieelastyczne oddziaływanie- zmiana stanu energetycznego atomu lub cząsteczki !!Ale zmiana częstotliwości może wyniknąć z ruchu cząsteczek rozpraszających - efekt Dopplera

12 Zmiana częstotliwości

13 Widmo światła rozproszonego

14 Fluktuacje natężenia

15 Wielkość mierzona - rodzaj eksperymentuNatężenie całkowite (rozpraszanie statyczne) - SLS Widmo światła rozproszonego (Interferometria Fabry-Perota) Fluktuacje natężenia światła rozproszonego (rozpraszanie dynamiczne) - DLS lub spektroskopia korelacji fotonów                                                               

16 Układ pomiarowy

17

18 Rozpraszanie promieniowania przez roztworyNatężenie promieniowania rozproszonego I(q): gdzie: RΘ jest współczynnikiem Rayleigha q - wektor rozpraszania, K - stała zależna od przyrządu oraz kontrastu optycznego dn/dc, c - stężenie wagowe, M - masa cząsteczkowa (wagowo średnia), P(q) - czynnik kształtu (interferencja wewnątrzcząsteczkowa), S(q) - czynnik struktury (interferencja międzycząsteczkowa)

19 Indykatrysy rozpraszania światłaDla cząsteczek małych w porównaniu z długością fali światła: d <<  Dla cząsteczek porównywalnych z długością fali światła: d  

20 Efekt interferencji wewnętrznej - spojrzenie IE1 = eikR Wektor falowy q = 0 Dj = 0 k = 2  n /  E2 = eikR Wektor rozpraszania q = 4  n/ sin /2 q = 2 k sin /2 Dj q q  0 Dj = k d sin  d E1 = eikR1 E2 = eikR2

21 Efekt interferencji wewnętrznej - spojrzenie IIE1 = eikR Dj q = 180° Dj = 2 k d E2 = eik(R+2d) E1 = eik(R+d) q = 0° Dj = 0 E2 = eik(R+d)

22 Rozpraszanie statyczne w roztworzeq2 tg  = 1/3 q2 Rg2

23 Wymiary: R = 10 nm R = 17.7 nm, h = 1 nm L=333 nm, d = 20 nm

24 Rozpraszanie statyczne w roztworzeKc/R siła jonowa                                   1/M c

25 radial distribution function (-> theory)

26 Rozpraszanie dynamiczneświatło rozproszone światło lasera t g(t) w I widmo natężenie funkcja korelacji

27

28 Spektroskopia Korelacji Fotonów(Photon Correlation Spectroscopy - PCS) Zastosowanie do badań submikrosopowych obiektów biologicznych. Co można zmierzyć: Współczynnik dyfuzji translacyjnej (DT): makrocząsteczek biologicznych (białka, kwasy nukleinowe), biologicznych układów supramolekularnych (organella komórkowe, pęcherzyki utworzone z błony lipidowej, asocjaty białkowe, mniejsze komórki) G(t) = g(2)(t) = 1 + exp(-2 q2 DTt).

29 Informacje z pomiaru spektroskopii korelacji fotonów (PCS)Pomiar DT - informacje o rozmiarze i kształcie obiektu rozpraszającego kula elipsoida obrotowa pałeczka „model kulkowy” DT = kBT/(6Rh)

30 Spektroskopia Korelacji Fotonów2. Z zależności DT od stężenia otrzymuje się informacje o sile i naturze oddziaływań między obiektami. odpychanie kompensacja przyciąganie c DT

31 Kula -najprostszy model hydrodynamiczyDT = kT/(6πηRH) RH Interpretacja np. współczynnika dyfuzji (+) Rozmiar (?) Kształt (?) Upakowanie (?) Hydratacja

32 Rh = [(3/4π)Vh]1/3 = [(3/4π)(Mw/NA)(v2 + δ1v1)]1/3Kombinacja RH z v2 i δ1v1 Vo = (Mw/NA)v2  (objętość „suchego” białka) VH2O = δ1 (Mw/NA)v1 (objętość dołączonej wody) Vh = Vo = VH2O    (objętość hydratowanego białka) Rh =  [(3/4π)Vh]1/3 = [(3/4π)(Mw/NA)(v2 + δ1v1)]1/3 Vh = (Mw/NA)(v2 + δ1v1) v2 - objętość właściwa cząsteczki, dla białek (cm3/g), średnio 0.73 (cm3/g) [na podstawie sekwencji] δ1 - hydratacja, dla białek (g H2O/g białka), średnio 0.35(g H2O/g białka) [na podstawie sekwencji] v1 – objętość właściwa wody związanej z makrocząsteczką, v1 = (cm3/g) RH = Rh F

33 Lizozym - model elipsoidy

34 L d Może się zdarzyć, że różne cząsteczki (modele) będą miały taki sam współczynnik dyfuzji. Trudniej (niemożliwe) jest znaleźć dwie różne cząsteczki z dwoma takimi samymi parametrami hydrodynamicznymi (np. współczynnikiem dyfuzji translacyjnej i rotacyjnej)

35 Kombinacje różnych parametrówparametry hydrodynamiczne informacje DT - współczynnik dyfuzji S - współczynnik sedymentacji τ - czas relaksacji rotacyjnej [η] - graniczna liczba lepkościowa Mw (masa), RH, Rg (rozmiar), υ1, ρ (objętość właściwa, hydratacja) a/b (kształt) giętkość stopień asocjacji

36 Kombinacja parametrówDT i DR (lub τ ) S i DT DT i [η] DT i Rg p=b/a lub p=L/d + informacje o objętości właściwej i hydratacji

37 Proste modele hydrodynamiczneelipsoida obrotowa wydłużona (p=a/b) BPTI elipsoida obrotowa spłaszczona (p=a/b) pałeczka (cylinder) (p=L/d) aktyna 20mer DNA

38 Modele kulkowe Wymagają informacji o budowie (np. z NMR lub krystalografii) i (F = -fv) , i = 1, 2, ..., N vi DT = kT -1 Programy obliczające parametry hydrodynamiczne na podstawie modelu kolkowego: HYDRO: HYDROPRO: HI4 (R. Pastor - u autora)

39 Różne typy modeli kulkowycha) b) c) a) model kula-atom domeny katalitycznej CBD, b) model kulka-aminokwas inhibitora trypsyny, BPTI, c) model dużych podjednostek dla immunoglobuliny IgG3.

40 Model „powłokowy” Kulka na atompierwotny model lizozymu, model wypełniony (filling model) powłokowy model lizozymu (pusty w środku, shell model)

41 Kulka na aminokwas

42 Kulka na nukleotyd Jedna kulka na nukleotyd Dwie kulki na nukleotyd

43 Zastosowania modelu kulkowe - celulazaKombinacja parametrów hydrodynamicznych z danymi krystalograficznymi, NMR i symulacją MC

44 Symulacja Rozkład współczynników dyfuzji dla modelu kulkowego giętkiego łącznika polipeptydowego. Rozmiar kulek  = 4.5 Å.

45 Wyniki symulacji a) Rozkład odległości między środkami domen dla celulazy b) zależność współczynnika dyfuzji od odległości między domenami, pozioma linia określa wyznaczony eksperymentalnie współczynnik dyfuzji, któremu odpowiada szeroki przedział konformacji modelu. a) b)

46 Podsumowanie Informacje najczęściej wykorzystywane w badaniach biologicznych: Współczynnik dyfuzji translacyjnej (DT), Promień hydrodynamiczny (Rh), Liczba składników w roztworze, Masa cząsteczkowa (dla każdego składnika osobno) w połączeniu z rozpraszaniem statycznym, Procentowy udział poszczególnych składników (w połączeniu z rozpraszaniem statycznym), Zjawiska asocjacji i agregacji, Kinetyka agregacji, Oddziaływania w roztworze, Ładunek efektywny cząsteczek, Mody drgań wewnętrznych dla dużych obiektów (np. długie fragmenty DNA), Kształt dużych obiektów (czynnik kształtu – pomiary kątowe).

47 Koniec