1 Secuenciación de DNA y BioinformáticaJosé A. Cardé, PhD Lab Biol 3306-Genética Universidad de Puerto Rico-Aguadilla
2 Objetivos Luego de haber completado el ejercicio, los estudiantes podrán: 1. Mencionar los dos métodos principales de secuenciar DNA. 2. Explicar el racional del uso del dideoxiribonucleótido en la estrategia de secuenciación. 3. Analizar una parte de una autoradiografía de una reacción de secuenciación real determinar la secuencia de un fragmento de DNA 4. Definir los que es bioinformática 4. Utilizar las bases de datos para un análisis de bioinformática de las secuencias obtenidas y determinar el gen al que corresponde.
3 Trasfondo Una vez usted obtiene el DNA se pueden hacer varias cosas con el durante su análissi: - Enzimas de restricción- mapas, clonar. - Southern Blot- agarosas, tamaños - Determinar secuencia Hay dos acercamientos básicos utilizados para análisis de secuencias de DNA Método químico, Maxim/Gilbert: Reacciones químicas con las bases Método enzimático, Sanger: replicación de templado con el dominio Klenow de la DNA polimerasa de E coli
4 Trasfondo Químico: Maxam and GilbertDegradar químicamente una de las bases Fragmentos radioactivos Electroforesis
5 Trasfondo Enzimático: Sanger/DideoxiInterrumpir la extensión de una cadena complementaria a la que se secuencia. Incorporación de ddNTP Electroforesis
6 Trasfondo: M13 Fago M13 Bacteriofago de E coli Genoma usado de vector~7200 pb Infecta cepa de E coli JM101 Entra al al célula por el factor de fertilidad F DNA SS pasa a DS Se expresa y se forman viriones Salen sin lisar
7 Trasfondo: M13 Genoma Fago M13 Bacteriófago de E coliGenoma usado de vector ~7200 pb Infecta cepa de E coli JM101 Polilinker para insertar DNA a secuenciar
8 Trasfondo: M13-EstrategiaFago M13 Oligonucleótido primer de 17 bases Complementario a flanco del polilinker Servira como primer Klenow replicará lo insertado Klenow: dominio polimerasa 53 de la DNA pol 1 de E coli. Le falta dominio exonucleasa 35
9 Reacción de Secuenciación4 reacciones 4 tubos con lo mismo: Klenow Templado a secuenciar Buffer para Klenow Los 4 dNTPs 32P-ATP ddA o ddT o ddG o ddC En cada tubo la misma reacción se detendrá en un ddNTP distinto.
10 Reacción de Secuenciación4 reacciones 4 tubos con lo mismo: Klenow Templado a secuenciar Buffer para Klenow Los 4 dNTPs 32PATP ddA o ddT o ddG o ddC En cada tubo la misma reacción se detendrá en un ddNTP distinto.
11 Reacción de Secuenciación4 reacciones 4 tubos con lo mismo: Klenow Templado a secuenciar Buffer para Klenow Los 4 dNTPs 32PATP ddA o ddT o ddG o ddC En cada tubo, la misma reacción se detendrá en un ddNTP distinto.
12 Reacción de SecuenciaciónFragmentos en nido Reacción G Cada fragmento se extendió hasta que se incorporó una G dideoxi Marcado radioactivamente por el 32 PATP Fragmentos de distintos tamaños interrumpidos por el ddGTP Así para los 4 ddNTPs
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14 Reacción de SecuenciaciónAutoradiografía - muestra - parte radioactiva - emulsión fotográfica - reducción de Ag - precipitado - lavados - bandas permanentes
15 Reacción de SecuenciaciónLectura de la gel Fragmentos separados por tamaño De abajo hacia arriba Cada fragmento se detuvo en la letra de su reacción Cada fragmento es complementario a lo que se estaba secuenciando
16 bioinformática campo de la biotecnología que se ocupa en el almacenamiento y la manipulación de secuencias de información de DNA. de estas se espera que se pueda obtener información biológica útil. diariamente, datos del análisis de secuencias de DNA son sometidos a una base de datos usando la internet (WWW) para identificar genes o productos de genes.
17 bioinformática Los datos de la secuenciación de DNA tiene usos limitado a menos que se pueda convertir en información biológica útil. Bioinformática es el componente crítico de la secuenciación porque se involucra en unir la tecnología computacional con la biotecnología. El uso diseminado del internet ha hecho posible la adquisición con relativa facilidad de información de distintos proyectos de genomas.
18 bioinformática En un análisis típico, como primer paso, luego de obtener la data de secuenciación de DNA, el biólogo molecular buscará similaridades de DNA usando varias bases de datos en el WWW. Esta búsqueda lo dirigirá a la identificación de DNA secuenciado o a identificar su relación con genes relacionados. Las regiones codificantes para proteínas pueden ser identificadas fácilmente por la composición de nucleótidos.
19 bioinformática Así mismo las regiones no codificantes se pueden identificar por la interrupción debido a codones de terminación. El significado funcional de las nuevas secuencias de DNA seguirá en aumento y será cada vez mas importante según se continúe generando mas y mas información y generándose mas y mejores motores de búsqueda.
20 Procedimiento El propósito de este ejercicio es introducir al estudiante a la bioinformática. Para que se obtenga experiencia en la búsqueda en bases de datos, los estudiantes utilizaran servicios gratuitos ya ofrecidos por el NCBI y que se puede acceder a través del WWW. Al presente ya hay varios de estos como GenBank, secuencias de nucleótidos en EMBL, las traducciones de los CDS no redundantes de GenBank (secuencias de proteínas).
21 Procedimiento Los estudiantes pueden usar cualquiera de estas bases de datos asi como otras disponibles en el internet para este ejercicio. Para simplificar se ilustrará el uso del NCBI. Estos ejercicios involucran el uso de BLASTN para comparar secuencias de nucleótidos y BLASTP para secuencias de aminoácidos en las bases de datos.
22 Procedimiento Escoges sequence analysis y en la pagina que aparece bajas y escoges Basic Local Aligment Search Tool (BLAST). Al llegar a la siguiente escoges nucleotide blast. Además de este hay otras opciones pero son para nosotros lo que nos interesa es para secuencias de nucleótidos.
23 Procedimiento Bajo nucleotide blast, click en el standard nucleotide-nucleotide BLAST (blastn). Las otras opciones son mas complicadas para aplicaciones especificas. Aquí hay tres secciones: enter query sequence choose search set program selection
24 Procedimiento Enter query sequencePara comenzar a entrar la secuencia escribe lo siguiente exactamente: atgcccggccccccaggggggcagaggcgccgc. Puede ser minúscula o mayúsculas. Una vez escrita la secuencia, click en el Blast .
25 Procedimiento A veces el servidor esta ocupado y los resultados tardan, solo hay que tratar de nuevo. A continuación hay un ejemplo de cómo se pueden esperar los resultados>
26 Procedimiento Al observar el reporte del Blastn nuestra secuencia presenta un pareo mejor con la proteína efectora CD42 humana. Esta fue la que obtuvo la mayor puntuación. Revisión de las dos secuencias alineadas muestra que nuestra secuencia de 32 nucleótidos es idéntica al segmento de nucleótido de CDC42. Como regla general, una identidad de nucleótidos de mas de 21 pb entre dos muestras indica usualmente que las secuencias están relacionadas. Excepción los poli A.
27 Procedimiento Obtenga una muestra de una autoradiografía y coloquela sobre una caja de luz blanca o alguna superficie blanca. Lee la gel de 53 esto es de abajo hacia arriba Lee primero 20 bandas y escríbelas Lee lueg 30 bandas y escríbelas. Ignora bandas muy pálidas.
28 Procedimiento Ejercicio 1:Para familiarizarse con las auto radiografías lea la secuencia #1. comience en la flecha o 6 cm desde el borde inferior y léala desde abajo por los primeros 20 nucleótidos. Regístrela y sométala al NCBI con Blastn. Comiéncela de nuevo pero léala hasta cubrir 30 nucleótidos. Registre, sométala usando Blastn. La secuencia se puede introducir directamente o leer, pasarla a un papel y luego al programa. Es crítico que usted no confunda los carriles mientras lee. La gel contiene carriles para A, C, G T de izquierda a derecha. Leer secuencias implica leer desde 53, esto se consigue de abajo hacia arriba. Note que la mayor parte del espacio entre nucleótidos y la intensidad de las bandas es básicamente similar. Ignore las bandas pálidas y escoja las oscuras. Resultados para muestra 1: cuales son los nombres de los genes? A cuales especies pertenecen los genes?
29 Procedimiento Ejercicio 2Ahora que estas familiarizado con la búsqueda por blast, lea la secuencia para la autoradiografia 2. Si hay duda en cuales bandas escoger, use su juicio. Ahora Lea la secuencia, comenzando unos 6 cm mas arriba del comienzo. Debe leer como sigue 5’…ggacgacggtatggaatagagaggaagttcct..3’ Someta la secuencia usando blasn Recuerde que la secuencia se introduce 53 El DNA es DS y contiene hebra superior 53 y la inferior 35. Algunas veces estas corresponden a la hebra codificante y no codificante. Si hay duda de las posiciones exactas con bandas exactas, use una N que significa que puede ser cualquier nucleótido. Una vez se reciba los resultados, baje y busque Resultados para muestra 2: Cual es el nombre del gen? Compárela con la secuencia del genbank, cual hebra usted leyó?
30 Procedimiento Ejercicio 3.Las secuencias se pueden acceder buscando en el GenBank por su numero de acceso. La información mostrada describe la secuencia del DNA y o el gen, los científicos que contribuyeron y cierta información como la proteína y la secuencia de aminoácido para el cual codifica. Resultados para la muestra 3: Cual es el nombre del gen? Aproximadamente cuantos aminoácidos tiene este gen?
31 Procedimiento Ejercicio 4Esta sección demuestra la interacción de dos proteínas codificadas por dos genes. Las interacciones proteína a proteína juegan un rol importante en virtualmente todos los procesos celulares.: Transducción de señal Lea la secuencia de DNA de la muestra 4. Comience desde abajo y registre la secuencia Luego comience 1/3 de la secuencia mas arriba y lea la secuencia desde ahí. Someta cada secuencia por separado usando Blastn Resultados de la muestra 4: esta muestra contiene dos secuencias de DNA, Cuales son los nombres de los genes? Cuales son las funciones de las dos proteínas codificadas? Como estas proteínas interactúan en una célula?
32 Preguntas de reflexiónDebiéramos hacer análisis prenatales para enfermedades que son incurables actualmente? Debiéramos hacer pruebas a nuestros hijos para enfermedades que se manifiestan en la adultez? Se le debe informar a los individuos los resultados de pruebas genéticas? Debieran tener las agencias de seguros la información sobre problemas genéticos para decidir sobre tus seguros? Cual debe ser el rol del gobierno al establecer las guías para pruebas genéticas en humanos? Se debieran permitir los experimentos con tejidos fetales humanos?
33 Referencias Alberts, et, al., (2014). Essential Cell Biology, 3rd Ed, Garland Science Publishing. New York. Brooker, Robert J. (2014). Genetics Analysis & Principles. (Quinta Edición). New York, McGraw-Hill Companies, Inc. NCBI – National Center for Biotechnology Information CSHL – Cold Spring Harbor Laboratory – Animations