1 SEMINARIO 4 Activación del ciclo celular asociada a muerte neuronal iniciada por daño al DNA.
2 CÉLULAS EN PROLIFERACION:Daño al DNA RELACIÓN Regulación del Ciclo celular Apoptosis
3 Neuronas postmitóticas terminalmente diferenciadasNeuronas asociadas a activación del Ciclo celular Expresión de proteínas relacionadas con el CC. Inhibición de esas proteínas tenía efectos neuroprotectores. Indices mitóticos elevados Enfermedades neurodegenerativas Tanto in vivo como in vitro las neuronas comprometidas a la muerte celular. Capacidad de replicar su DNA. APOPTOSIS DAÑO DNA
4 Neuronas postmitóticas terminalmente diferenciadasMayor sensibilidad DAÑO DNA Deficiencia en la reparación de DNA
5 Neuronas postmitóticas terminalmente diferenciadasDaño al DNA RELACIÓN ?? Regulación del Ciclo celular Apoptosis
6 HIPOTESIS: La activación del ciclo celular,es un componente importante de la respuesta al daño de DNA, en neuronas postmitóticas terminalmente diferenciadas APOPTOSIS Reentrada al CC Agentes genotoxicos
7 HIPOTESIS: La activación del ciclo celular,es un componente importante de la respuesta al daño de DNA, en neuronas postmitóticas terminalmente diferenciadas APOPTOSIS Reentrada al CC Agentes NO genotoxicos
8 Cultivos de corteza cerebral de embriones de rata en dia 18: > 99 % de las cëlulas expresaban MAP 2 ( especifica de neuronas) y GFAP ( celulas de la glia): CITOMETRIA DE FLUJO
9 Tiempo de cultivo entre 4 y 8 dias: % de celulas en fase S disminuia al 3 % ( neuroblastos)
10 AGENTES NO GENOTOXICOSEtoposido Homocisteina Peptido β amiloide Metrotexate AGENTES GENOTOXICOS Estaurosporina Colchicina AGENTES NO GENOTOXICOS
11 HIPÓTESIS 1 DAÑO EN EL DNA INDUCE LA PRODUCCION Y ACTIVACION DEL SUPRESOR TUMORAL PROTEINA p53 EN MUCHOS TIPOS CELULARES, INCLUIDAS LAS NEURONAS.
12 •CONTROLAR LA PROGRESIÓN DEL CICLO CELULAR Y LA APOPTOSIS PROTEINA p53 : es el producto de un gen supresor tumoral que cumple un rol crítico en la respuesta celular al daño del ADN , previniendo así la perpetuación de las mutaciones u otras anomalías cromosómicas en las células hijas. Sus funciones incluyen: •SENSAR EL ADN DAÑADO •CONTROLAR LA PROGRESIÓN DEL CICLO CELULAR Y LA APOPTOSIS •PARTICIPAR EN LA REPARACIÓN DEL ADN.
13 El daño al ADN aumenta la capacidad de p53 de activar genes específicos que ayudan a la célula a superar el daño. Además p53 estimula la producción de enzimas que intervienen en la reparación. El ciclo se detiene en G1 y G2 hasta que se repara el daño. Si éste es muy extenso, p53 activa la expresión de genes que conducen a la APOPTOSIS.
14 HIPÓTESIS 2 DAÑO EN EL ADN ACTIVA EL CICLO CELULAR EN NEURONAS, EVIDENCIANDO UN AUMENTO EN LA EXPRESION DE Cdc25A.
15 Cdc 25A es un bien establecido regulador de la progresión G1-S y marcador de entrada en fase S , a través de su interacción con el sistema ciclina-CDK. Pertenece a la familia de fosfatasas que incluyen 3 homólogos en mamíferos: Cdc25A, B y C . Se expresa en la fase media de G1 e induce la entrada en S.
16 EXPRESIÓN de p53 y Cdc 25A en neuronas tratadas con agentes genotóxicos versus no genotóxicosExpresion de p53 y Cdc25A luego de 14hs de tratamiento con Hom, Aβ, Sts. P53 Cdc25A Colocalización
17 RESULTADO: FUERTE EXPRESIÓN de p53 y Cdc25A en neuronas corticales expuestas a HOMOCISTEÍNA y Aβ PERO NO A STAUROSPORINA.
18 Se confirmó el aumento de expresión por inmunoblotSe lisaron las células. Las proteínas fueron separadas por tamaños por electroforesis en gel de poliacrilamida y transferidas a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se incubó con Anticuerpos primarios contra fosfo-p53 , Cdc25A o Actina. Las membranas fueron expuestas a un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa . Se visualizaron bandas inmunorreactivas por quimioluminiscencia. Se hizo un análisis densitométrico de los blots y se expreso la intensidad de la señal corregida contra los blots de actina como proporción de la señal de control.
19 Se confirmó el aumento de expresión de p53 y Cdc25A por INMUNOBLOTINMUNOBLOT MOSTRANDO NIVELES DE EXPRESIÓN DE p53 y Cdc25A 1-Control. 2-St a las 7 hs. 3-Hom a las 7 hs. 4-Aβ a las 7 hs. 5-St a las 18 hs. 6- Hom a las 18 hs. 7- Aβ a las 18hs.
20 Conclusion LA EXPRESIÓN DE p53 Y Cdc25A EN NEURONAS CORTICALES LUEGO DE LA EXPOSICIÓN A HOMOCISTEÍNA Y Aβ REFLEJA LA RESPUESTA DE LAS NEURONAS AL DAÑO DEL ADN Y LA ACTIVACIÓN DEL CICLO CELULAR RESPECTIVAMENTE
21 Determinación de reentrada al CC y replicación del DNA (Fase S)Cultivos de Neuronas Postmitóticas se expusieron a: Agentes Genotóxicos Agentes No Genotóxicos Control Etopósido 1μM - 20 hs Homocisteína 250 μM - 30 hs Metotrexato 20 μM - 30 hs Aβ μM - 30 hs Staurosporina 2μM - 24 hs Colchicina 0,5μM - 24 hs
22 Citometría de Flujo Técnica que permite medir la cantidad de DNA en forma individual en cada célula. Fundamento: Unión al DNA de una sustancia fluorescente Medición a través del citómetro de flujo de la intensidad de la fluorescencia la cual es proporcional a la cantidad de fluorocromo, que a su vez, es proporcional a la cantidad de DNA presente en la célula.
23 Fluorocromo: Propidium iodide (PI)Fluorocromo intercalante del DNA y RNA de doble cadena. Para medir sólo DNA se debe utilizar RNAasa. Trabajar con células muertas y fijadas. Excitación en el azul/verde-rojo. Tinción con PI 10 μg/ml 30 min. en oscuridad Fijado RNAasa (100 μg/ml) Citometría de flujo
24 Ciclo Celular 4n 2n
25 Perfiles típicos de distribución del ciclo celular en neuronas corticales de ratones en cultivos Control, con Etopósido y con Staurosporina
26 Incremento significativo de neuronas en fase S luego del tratamiento con Metotrexato, Homocisteína y Etopósido. Con Staurosporina y Colchicina los valores fueron menores que el control.
27 Conclusiones Los agentes genotóxicos inducen Replicación del DNA en neuronas postmitóticas. Los agentes apoptóticos no genotóxicos no inducen esta reentrada al ciclo celular. Se vió que la supresión de las cdks produce un efecto neuroprotectivo posiblemente por perturbación de la respuesta al daño al DNA y la apoptosis neuronal asociada.
28 Determinación de reentrada al CC y replicación del DNA (Fase S)Cultivos de Neuronas Postmitóticas se expusieron a: Agentes Genotóxicos Agentes No Genotóxicos Control Etopósido 1μM - 20 hs Homocisteína 250 μM - 30 hs Metotrexato 20 μM - 30 hs Aβ μM - 30 hs Staurosporina 2μM - 24 hs Colchicina 0,5μM - 24 hs
29 Citometría de Flujo Técnica que permite medir la cantidad de DNA en forma individual en cada célula. Fundamento: Unión al DNA de una sustancia fluorescente Medición a través del citómetro de flujo de la intensidad de la fluorescencia la cual es proporcional a la cantidad de fluorocromo, que a su vez, es proporcional a la cantidad de DNA presente en la célula.
30 Fluorocromo: Propidium iodide (PI)Fluorocromo intercalante del DNA y RNA de doble cadena. Para medir sólo DNA se debe utilizar RNAasa. Trabajar con células muertas y fijadas. Excitación en el azul/verde-rojo. Fijado RNAasa (100 μg/ml) Tinción con PI 10 μg/ml 30 min. en oscuridad Citometría de flujo
31 EXPERIMENTO Nº2 OBJETIVO:Relacionar la inducción a la progresión del ciclo celular con el daño en el ADN y la muerte celular MATERIALES Y MÉTODOS: Cultivos de células neuronales corticales entre el día 4 y 8 Agentes genotóxicos: Etoposido, homocisteína, metotrexato, Aβ1-42 Agentes no genotóxicos: colchicina, estaurosporina Comet assay: cuantificación del daño del ADN Tinción de Hoechst: cuantificación de la apoptosis
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36 CONCLUSIONES AGENTES GENOTÓXICOS Homocisteína Metotrexato Aβ1-42Etoposido AGENTES NO GENOTOXICOS Colchicina Estaurosporina Daño al ADN Apoptosis No daño al ADN Apoptosis
37 CURVAS CINÉTICAS DE LOS AGENTES UTILIZADOSA- etoposido 1μM B-Estaurosprina 2μM C-Colchicina 0.5μ
38 En que momento del ciclo ocurre la apoptosis?Cultivo de neuronas Exposición al agente en presencia de BrdU Cosecha Fijación en etanol 70% Tinción multicolor
39 +Ac antiBRdU-PHOENIXREDCuantificación simultánea de apoptosis y replicación Estrategias experimentales Apoptosis TUNEL: TdT+ BrdUTP-FLUORESCEÍNA Replicación Exposición a luz UV +Ac antiBRdU-PHOENIXRED
40 Cuantificación de apoptosis y replicación Resultados de la citometría de flujoPorcentaje significativo de replicación ligada a apoptosis Porcentaje no significativo
41 La citometría de flujo provee una estimación cuantitativa del DNA en cada neurona, demostrando una transición de G1 a S en respuesta al daño por genotóxicos. En estos casos la reentrada al ciclo celular y la replicación serían un mecanismo crítico que conducirían a la apoptosis.
42 Objetivos Definir la cascada involucrado en respuesta al daño de DNA en neuronas postmitoticas que resulta en la reentrada al CC. Evaluar el % de neuronas apoptoticas, % de neuronas en fase S y daño de DNA en presencia de ATM inhibido y ante la intervencion con distintos agentes que dañan DNA .
43 ATM ATM: Proteína del grupo proteinkinasas PIK3.Las PI3K es una serie de proteínas identificadas en varios organismos, las cuales se encuentran involucradas en diferentes checkpoints de la progresión del ciclo celular, respuesta al daño de DNA, en procesos de recombinación y mantenimiento de la estabilidad del genoma.
44 El daño de DNA activa a la proteinquinasa ATM, que fosforila a Chk2, para estimular asi su actividad quinasa La Chk2 activada fosforila a la fosfatasa Cdc25A y la marca para su poliubiquitinización. ATM fosforila a p53 en un sitio que interfiere con su union a Mdm2, aumentando su capacidad de activar la transcripción de genes que permitan reparar el daño de DNA ( entre otros p21)
45 La supresión de la función de ATM en cultivos de neuronas corticales previene la apoptopsis y activación del ciclo celular inducida por etopósido?
46 La supresion de la función de ATM impide la reentrada en el CC inducida por etopósido?
47 Se sugiere un rol clave de la vía ATM-Chkd2 en el control en respuesta al daño de DNA, conduciendo a la activación del ciclo celular y apoptosis en neuronas postmitóticas. La inhibición de la función de ATM, tiene un efecto prtector de la apoptosis inducida por etoposido, no siendo asi para staurosporina.
48 Objetivo Evaluar el % de neuronas apoptóticas ante la intervención con Etop Aß y Sts en ratones KO para ATM con respecto a ratones WT.
49 Ratones knockout Genotipificación por metodología de PCR
50 La apoptosis inducida por etoposido o Aßen cultivo de neuronas de ratones KO para neuronas fue significativamente menor comparada con los cultivos de ratones WT. No existieron diferencias en la apoptosis entre los ratones WT y KO ante la intervención con Sts.
51 Objetivo: Determinar el rol en procesos neurodegenerativos de la re-entrada al ciclo secundaria al daño del DNA, en modelos In vivo Ratón transgénico con sobreexpresión de APP (modelo experimental de Alzheimer) En los controles y en los mutantes midieron: Concentración APP Presencia 8 oxodG Actividad enzimática mOGG1
52 Las nucleobases y la deoxiribosas son factibles de oxidación generando distintas lesiones: 8 oxodG8 oxodG se encontró en cerebro postmortem en humanos con Alzheimer Ogg1 Pertenece a la superfamilia de endonucleasas III. Tiene función glicosilasa y AP liasa Reconoce 8 oxodG y lo remueve por sistema de Reparación por Excisión de Bases (simil a una de las enzimas del Sistema GO en E. Coli )
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54 Hallaron relación entre el deposito b Amiloide, el aumento de bases con daño oxidativo y la disminución de la eficiencia enzimática en la remoción de las mismas (Falla en el sistema de Reparación)
55 Conclusiones No se duerman que ya terminamos!!!!
56 Conclusiones En células proliferantes, el daño al DNA resulta en la activación de mecanismos que detienen el ciclo celular en checkpoints específicos para dar lugar a la reparación. Sin embargo, si el daño es demasiado extenso para ser reparado, se activa la apoptosis celular.
57 Conclusiones En células postmitóticas terminalmente diferenciadas como las neuronas, el daño al DNA induce reentrada al ciclo celular pasando por la fase S La reentrada al ciclo celular sería un paso indispensable para la activación de la maquinaria de reparación del DNA.
58 Conclusiones Otros estudios recientes han demostrado que las enzimas involucradas en la reparación del DNA tienen mayor actividad en las células en proliferación que en las diferenciadas. Nuclear uracil-DNA glycosilase (UNG) mOgg Ku70
59 Conclusiones La reentrada al ciclo celular en neuronas diferenciadas puede contribuir a la apoptosis de las células con DNA dañado y no reparado. La reparación del DNA es crítica para el SNC, sin embargo, con estos resultados vemos que las neuronas son más vulnerables al daño al DNA que sus precursores.