1 Simposio Concenso de Hepatitis B El Virus de la Hepatitis B22-23 noviembre de 2002 El Virus de la Hepatitis B A.A.E.E.H.

2 Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002• Virus de la Hepatitis B (HBV) - Clasificación • El descubrimiento del HBsAg por Blumber y Col. (1965). • Dane y Col (1970) detectaron el virus de la hepatitis B completo (HBV). • El sistema antígeno-anticuerpo (HBe Ag-AcHBe) relacionado con la infectividad fue descripto por Maquius y Espnark, en 1972. • Pertenece al género hepadnavirus, que se caracteriza por ser un virus DNA hepatotropo. • EL HBV es un virus complejo, contiene uno de los genómas más pequeños de todos los virus animales conocidos. • Posee un DNA pequeño parcialmente bicatenario con genes fuertemente solapados. • Presenta mecanismos inusuales de replicación de DNA viral que incluyen TRANSCRIPCION INVERSA a partir de RNA de mayor longitud que el DNA viral (Summer 1982). Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002 A.A.E.E.H.

3 Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002• VIRUS DE LA HEPATITIS B Envoltura Antígeno de Superficie mediana Nucleocápside Superficie pequeño Superficie grande DNA Genómico Primer DNA Polimerasa El HBV está formado por partículas esféricas de nm de diámetro, rodeado de una envoltura proteolipídica de 7 nm de espesor que contienen tres formas de AgS (Dane y Col, 1970, Mason y Col, 1980). • En el interior se observa un núcleo esférico “Core” electrodenso de nm. que contiene: *DNA viral. *DNA polimerasa. *Ag viral C (HBcAg). *DNA primer: iniciador de replicacíon • El Ag “e” (HBeAg) no forma parte de su estructura sino que se sintetiza a partir del gen C que codifica las proteínas del core. Raneyal, Mc Lachianp Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002 A.A.E.E.H.

4 Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002• Partículas virales • La concentración de partículas virales en el suero de pacientes infectados pueden exceder las 109 part/ml. Además de las partículas virales se encuentran en el suero otras formas particuladas (esferas y filamentos) llamadas partículas S, compuestas sólo por HBsAg en número superior a las de las partículas infecciosas. • Estas partículas contienen lípidos, carbohidratos y proteínas, pero no componentes del core del virión, y se las considera formas incompletas de la envoltura. VIRUS FILAMENTO ESFERA Micrografía electrónica 22 nm de espesor 16-25 nm partículas MHBs LHBs SHBs Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002 A.A.E.E.H.

5 Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002• Estructura del genóma viral • El genoma de los Hepadnavirus es extraordinariamnete compacto. • DNA circular parcialmente de doble cadena de 3200 nucleótidos. • Cadena larga o negativa de 3.2 Kb. No es un circulo cerrado • Cadena corta o positiva de longitud variable, pb. • Los extremos 5´ de ambas cadenas de DNA no pueden ser fosforilados, hecho que condujo al descubrimiento de un polipéptido que actúa como Primer. • La longitud del genoma varía según el subtipo viral. • Las posiciones de las diferentes características del genoma se indican según numeración de Ono et. al. (1983). Se inicia en la posición correspondiente al corte con la enzima EcoRI. • En el núcleo del hepatocito se produce un intermediario cccDNA por acción de la polimerasa viral. Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002 A.A.E.E.H.

6 Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002• Genóma del virus de la Hepatitis B • Posee 4 ORFs (C,S,P,X) fuertemente solapado, que se transcriben a 5 mRNA. • La síntesis de cada uno de los mRNA esta dirigido por su promotor correspondiente. • La actividad de los promotores esta regulada por los enhancers. Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002 A.A.E.E.H.

7 RNA Core (pregenómico) Señal de encapsulación• Características de los genes (ORF) del HBV RNA Precore RNA Pre-S2/S RNA Pre-S1 RNA Core (pregenómico) RNA X Señal de encapsulación Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002 A.A.E.E.H.

8 - DNA polimerasa (proteína P).• Estructura del Genóma Viral - Gen C • Situado en posición , presenta 2 codones de iniciación en fase • La secuencia corta situada entre dos codones de iniciación se denomina pre C o precore. • El gen precore/core se transcribe a 2 mRNA: -mRNA precore traduce la proteína HBeAg de Da. -mRNA Core traduce: - HBcAg de Da. - DNA polimerasa (proteína P). y actúa como RNA pregenómico. Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002 A.A.E.E.H.

9 Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002• Proteínas codificadas por el Gen C (HBcAg y HBeAg) GEN PRECORE-CORE HBV POLIMERASA HBcAg 185 RNA pregenómico 1821 RNAcore Traducción Transcripción Precore Core 2307 Stop 2456 DNA 1814 Transcripción 1792 RNAprecore Proteína precore 185 291 Traducción p22e 185 291 19 HBeAg 151 291 19 Secreción Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002 A.A.E.E.H.

10 Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002• Características y función de las proteínas del gen precore/core HBcAg • La proteína core HBcAg es blanco para la inmunolisis celular mediada por células T (Moreno 2000). HBeAg No interviene en la replicación viral, sin embargo su región se conserva en todos los Hepadnavirus • Función inhibitoria – Mutación 1896: no produce HBeAg, incrementa replicación viral (Lambert 1993). Otra mutaciones en el PBC alteran su producción y estarían implicadas en la cronicidad y daño hepatocelular. (mutación 1764) • Modulación inmunológica: al compartir epítopes con HBcAg es reconocido por células T citotóxicas. • Función inductora de tolerancia inmunológica “in útero” (Millich 1990).º Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002 A.A.E.E.H.

11 Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002• Estructura del Genóma Viral – GEN S • Situado en posición • Presencia de tres codones de iniciación en fase. • Define tres regiones denominadas PreS1, PreS2 y S • Codifica los péptidos de envoltura del virión y partículas no infectivas. • La especificidad en las proteínas de superficie esta constituida en tres polipéptidos de la envoltura del HBV compuestos por formas glicosiladas y no glicosiladas. • Daltons - Región S (p24/gp37) --> SHBs --> Reside la especifidad antigénica (Subtipos). • Daltons - union pre S2-s (p33/gp36) --> MHBs --> Unión a receptor HSA. • Daltons - 3 regiones pre S1 - pre S2 - S (o sea ORF completo) (p39/gp42) --> LHBs > Unión a hepatocito. Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002 A.A.E.E.H.

12 Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002• Características de las proteínas del Gen S Gm Inhibición secreción Unión hepatocito 6-19 27-47 119 1 226 113 Sitio proteólisis unión lectina hígado unión HSA 47 translocación ret. endoplas. stop membrana “loop” antigénico …-122…137…146…149…160 a subtipos Lys d y Arg r w 226 a.a. P24-G27 SHBs Gc GP33-36 281 a.a. MHBs Asn 4 S N pre S1 pre S2 P39-GP42 LHBs 400 a.a. Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002 A.A.E.E.H.

13 Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002• Estructura del Genóma Viral – GEN P Primer 1 178 Región espaciadora 304 336 P Transcriptasa Reversa/Polimerasa 680 838 RNasa DNA 2302 Proteína C 2455 2854 3210/1 PreS1 3211 155 PreS2 833 S Enhl 1374 X 1623 * Situado en posición * Codifica un polipeptido básico de , que posee 4 dominios con actividad: - Proteína terminal o primer. - Región espaciadora. - Transcriptasa reversa / DNA polimerasa. - RNasa. * Interviene en la encapsulación del RNA pregenómico para su posterior retrotranscripción. Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002 A.A.E.E.H.

14 • Estructura del Genóma Viral – GEN X1 154 ADN Proteína 13 30 48 57 72 78 88 103 143 21 50 61 91 101 5´ 3´ 60 76 110 139 Región conservada Dominio transactivador 1374 1621 1814 1836 P X DR2 Enh2 DR1 Dominio regulador Región rica en serina/prolina 126 141 • Situado en posición • Codifica un polipéptido de aa (HBx). Proteína reguladora que actúa como activador transcripcional • Capacidad de inducción a carcinoma hepatocelular (Morearty y Col. 1985). Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002 A.A.E.E.H.

15 Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002• Elementos reguladores del genoma viral Genoma Viral 3221 DNA cebador Gen P loop antigénico subtipos Mutaciones Atg Atg precore Gen C pre S1 pre S2 Unión HSA Unión a hepatocito Gen X 1 preS2 S encapsulación SEÑAL DE ENCAPSULACION: Importante estructura secundaria. Selección de mRNA pregenómico. U5 REGION U5 ANALOGA A RETROVIRUS: Region altamente conservada. DR DR1 DR1 - DR2: Secuencias fuertemente conservadas. Intevienen en la replicación. GC RESPUESTA GLUCOCORTICOIDES(GC): Intencifica la expresión génica. poli A POLI A: Terminación de transcriptos. Prom pre S2 Prom pre S1 Prom X PROMOTORES: Iniciadores de la transcripción. Forman parte integral del gen. Prom Precore-core enh I enh II ENHANCERS(I y II): Activadores. Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002 A.A.E.E.H.

16 Activador transcripcional Morfología de la partículaResumen Transcripción/Traducción PROMOTOR 4ORF 5mRNA 7 PROTEINAS TRANS. TRAD. X Gen X mRNA X HB X Activador transcripcional PreS1 PreS2 Morfología de la partícula Unión a hepatocito Subtipos virales Gen S mRNA preS1 mRNA preS2/S LHB S MHB SHB Precore-core Antígeno soluble en suero Nucleocápside Polimerasa Retrotranscriptosa RNasa Gen C Gen P mRNA precore mRNA core HB e HBc Proteina P Primer REPLICACION VIRAL RNA pregenómico Simposio Concenso de Hepatitis B | noviembre 2002 A.A.E.E.H.