1 Słów kilka o teście korekcji.Paweł Kozłowski Laboratorium Centralne SP CSK Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej WNoZ WUM Lublin 13 maja 2017

2

3 Test korekcji: Wykonujemy gdy stwierdzamy u chorego wydłużony APTT.Mieszamy osocze badane z osoczem prawidłowym. Jeśli dochodzi do korekcji stwierdzamy niedobór czynnika, jeśli nie ma korekcji stwierdzamy obecny inhibitor.

4 APTT W 1961 roku Rapaport i Proctor opracowali protokół testu określanego do dziś mianem APTT (ang. activated partial thromboplastin time). badanie w osoczu ubogopłytkowym; dodatek aktywatora i fosfolipidów – inkubacja w temp. 37oC – maksymalna aktywacja czynników kontaktu; dodanie chlorku wapnia; pomiar czasu potrzebnego do wytworzenia skrzepu. Samuel I. Rapaport

5 ZASADA METODY OZNACZANIA APTTMAKSYMALNA AKTYWACJA DROGI WEWNĄTRZPOCHODNEJ OSOCZE AKTYWATOR FOSFOLIPIDY + Ca2+ SKRZEP

6

7 APTT zależy od: aktywności czynników: II, V, VIII (vWF), IX, X, XI, XII; stężenia fibrynogenu; terapii heparyną niestandardową i doustnymi antykoagulantami (VKA przy przedawkowaniu), DOACs; obecności w próbce: a) heparyny niefrakcjonowanej, b) przeciwciał przeciw czynnikom krzepnięcia lub fosfolipidom (tzw. krążące antykoagulanty/inhibitory).

8 inhibitor p. czynnikowiAPTT lek niedobór czynnika inhibitor 1 czynnik 2 lub więcej czynników p/ciało zależne od PL inhibitor p. czynnikowi aloprzeciwciało autoprzeciwciało

9 Czy test korekcji APTT rzeczywiście jest taki prosty?Kiedy wykonać? Jak wykonać? Jak interpretować?

10 Jakiego rzędu wydłużenie APTT powinno skutkować wykonaniem testu korekcji?

11 W przypadku izolowanego wydłużenia APTT najpierw należy wykluczyć obecność heparyny niefrakcjonowanej i DOACs.

12 Jak wykonać test korekcji APTT?Osocze badane Osocze prawidłowe (osocze normalne) W jakim stosunku mieszać? Inkubować, czy nie inkubować?

13 Osocze prawidłowe (normalne) PNP (ang. pooled normal plasma)

14 Osocze prawidłowe (normalne) PNP (ang. pooled normal plasma)Dawcy – co najmniej 20 zdrowych osób w wieku lat, najlepiej połowa mężczyzn i połowa kobiet, którzy nie przyjmują żadnych leków wpływających na układ hemostazy. Dopuszcza się włączanie kobiet przyjmujących antykoncepcję. Pobranie krwi – powinno nastąpić pomiędzy 9-11 rano, gruba igłą, na cytrynian trisodowy (109 M; 3,2%). Preparowanie osocza – jak najszybciej oddzielić osocze wirując krew w warunkach (15 minut 2500g, 4oC) zapewniających otrzymanie osocza ubogopłytkowego (PLT < 10 tyś./ul). Osocze od dawców zmieszać a następnie podzielić na mniejsze porcje i zamrozić (najlepiej w -70oC) w probówkach wykonanych z materiału, który nie powoduje aktywacji czynników kontaktu.

15 Osocze prawidłowe (normalne) PNP (ang. pooled normal plasma)Zakłada się, iż w tak przygotowanym osoczu prawidłowym, aktywność czynników: II, V, VII, IX, X, XI, XII, wielkocząsteczkowego kininogenu i prekalikreiny wynosi około 100 U/dl. Aktywność czynnika VIII i vWf mogą się różnić. Możliwe jest wyznaczenie aktywności czynników krzepnięcia PNP względem międzynarodowych standardów. Wtedy ich aktywność wyrażona jest w jednostkach IU (ang. international unit). PNP powinno zawierać mniej niż 10 tyś/ul PLT

16 4 1 2 3 + 1:1 Inkubacja 1-2 godziny 37oC PNP Chory PNP+C 1:1Oznaczenie APTT w probówkach 1, 2, 3, 4 1 2 3 1:1 +

17 Interpretacja testu korekcji APTTprobówka APTT 1 PNP NORMALNY 2 CHORY 3 MIESZANINA INKUBOWANA KOREKCJA 4 MIESZANINA NIEINKUBOWANA INTERPRETACJA WYNIK PRAWIDŁOWY NIEDOBÓR CZYNNIKA/ÓW NATYCHMIASTOWY INHIBITOR ZALEŻNY OD CZASU

18 APTT a niedobór czynnika/czynników3 CZYNNIKI 2 CZYNNIKI 1 CZYNNIK AKTYWNOŚĆ CZYNNIKA [%]

19 ROZRÓŻNIAMY INHIBITORYZALEŻNE OD CZASU NIEZALEŻNE OD CZASU INHIBITORY CZYNNIKA VIII: aloprzeciwciała (w leczeniu substytucyjnym ciężkiej wrodzonej hemofilii A) autoprzeciwciała (nabyta hemofilia A) INHIBITORY CZYNNIKA IX: w leczeniu substytucyjnym ciężkiej postaci wrodzonej hemofilii B choroby układowe tkanki łącznej po porodzie w nowotworach złośliwych ANTYKOAGULANT TOCZNIA

20 Przeciwciała w APS LA (antykoagulant tocznia) – heterogenna grupa przeciwciał, które reagują z naładowanymi ujemnie lub obojętnymi fosfolipidami. cCL (przeciwciała przeciwko kardiolipinie) – antygenem dla nich jest kardiolipina (difosfatydyloglicerol). Wykrywa się je w klasie G i M za pomocą standaryzowanych testów ELISA. p/ciała przeciwko beta2-glikoproteinie I – heterogenna grupa przeciwciał reagujących z różnymi domenami beta2-glikoproteiny I, znaczenie w APS mają te, które łączą się z domeną I. Wykrywa się je w klasie G i M za pomocą standaryzowanych testów ELISA. p/ciała przeciwko fosfatydyloserynie; p/ciała przeciwko fosfatydyloetanoloaminie; p/ciała przeciwko protrombinie i kompleksowi protrombina-fosfatydyloseryna.

21 Klasyczna hemofilia A Nabyta hemofilia Mechanizm Brak lub zmniejszona synteza czynnika VIII Przeciwciała blokujące czynnik VIII Sposób dziedziczenia Związany z płcią Choroba nabyta Kto choruje Mężczyźni, kobiety nosicielki w rzadkich przypadkach mogą mieć zwiększoną skłonność do krwawień Kobiety i mężczyźni, w przedziale lat częściej kobiety, niezwykle rzadko dzieci Częstość występowania 1/5-10 tyś. męskich noworodków ok. 1,5/1mln mieszkańców (częstość wzrasta z wiekiem) Mutacje genu czynnika VIII Są przyczyną choroby Nie występują Obraz kliniczny Zależy od ciężkości choroby. Krwawienia nie ujawniają się zaraz po urodzeniu. Krwotoki do stawów, artropatia hemofilowa. Nagły, ciężkie krwawienia skórno-śluzówkowe, do mięśni, do OUN, z ran, z przewodu pokarmowego i moczowego, rozległe wylewy podskórne, ale nie do stawów

22 AHA przyczyny Poliklonalne autoprzeciwciała klasy IgG Postać klinicznaOpis Idiopatyczna Około 50% przypadków. Nie udaje się znaleźć uchwytnej przyczyny w postaci choroby współistniejącej. Poporodowa Stanowi ok % przypadków AHA. Występuje nie częściej niż 1/350 tyś porodów. Rozpoczyna się zwykle od 1-4 miesiąca po porodzie. Wtórna W około 30-45% przypadków można powiązać AHA z: Chorobami autoimmunologicznymi, złośliwymi guzami litymi, nowotworami hematologicznymi, chorobami alergicznymi. Reakcja polekowa: penicylina, sulfonamidy, interferon alfa, leki przeciwpsychotyczne.

23 Inhibitor czynnika VIII we wrodzonej hemofilii ACiężka postać hemofilii A Umiarkowana/łagodna 30% 1-7% Około 5-7% chorych na hemofilię A wytwarza inhibitor Inhibitor pojawia się zwykle w dzieciństwie po kilku dniach ekspozycji na czynnik Miano >5 j.B/ml (>50% przypadków), szybko neutralizują czynnik, ponowne podanie czynnika prowadzi do szybkiego wzrostu ich miana (odpowiedź anamnestyczna). silny inhibitor Miano < 5 j.B/ml przez cały czas, dość wolno neutralizują czynnik, ich miano po jego podaniu narasta powoli. słaby

24 Inhibitor czynnika VIIITyp I Typ II AUTOPRZECIWCIAŁO ALOPRZECIWCIAŁO Czas [h]

25 Czy doszło do korekcji? 10% wartości APTT PNP (www. fritsmafactor.com)np: APTT PNP – 30s (10% - 3s) - APTT mix < 33s – korekcja -APTT mix > 33s – brak korekcji APTT PNP + 5s (www.fritsmafactor.com) „Badania laboratoryjne w hematologii” wydanie I, PZWL Warszawa 2003 [APTT c – APTT mix] [APTT c – APTT pnp]/2 > korekcja < brak korekcji Indeks Rosnera Wzór Changa (procent odchylenia)

26 Indeks Rosnera (RI) = APTT mieszaniny – APTT pnp X 100% APTT choregoRI < 12% - korekcja RI > 15% brak korekcji RI 12-15% - wynik niepewny

27 mix 1:1 > 70% - korekcja APTT < 58% - brak korekcji APTTAm J Clin Pathol 2002; 117: 62-73 mix 1:1 > 70% - korekcja APTT < 58% - brak korekcji APTT 58-70% - szara strefa > 75% - korekcja PT < 70% - brak korekcji PT 70-75% - szara strefa

28 Ocenie poddano 3 grupy próbek osocza:Grupa 1 – próbki osocza, w których przynajmniej jeden czynnik < 50% aktywności. Grupa 2 – próbki osocza, w których uzyskano negatywny wynik testu na antykoagulant tocznia, oraz aktywność żadnego z czynników nie była mniejsza niż 50%. Grupa 3 – próbki osocza, w których uzyskano dodatni wynik testu na antykoagulant tocznia (dRVVT).

29

30

31

32

33

34

35

36

37 Zespół antyfosfolipidowy APSkryteria laboratoryjne kliniczne Sydney 2004/2006

38 Kryteria laboratoryjne zespołu antyfosfolipidowegoKeeling D. et al. British Committee for Standards in Haematology British Journal of Haematology 2012; 157: 47-58 Obecny w osoczu antykoagulant tocznia (LA) wykryty przynajmniej 2-krotnie w odstępie co najmniej 12 tygodniowym. Obecne w osoczu p/ciała przeciwko kardiolipinie (aCL) w klasie G i/lub M w średnim lub wysokim mianie stwierdzone co najmniej 2-krotnie w odstępnie co najmniej 12 tygodniowym. Obecne p/ciała przeciwko beta2-glikoproteinie I w klasie G i/lub M w średnim lub wysokim mianie wykryte co najmniej 2-krotnie w odstępnie co najmniej 12 tygodniowym.

39 dRVVT plus APTT lub inneWykrywanie LA Rekomendacje 2009 (1) 2012 (2) 2014 (3) Testy APTT i dRVVT dRVVT plus APTT lub inne 1 – Pengo V., et al. Update of the guidelines for lupus anticoagulant detection. Journal of Thrombosis and Haemostasis 2009; 7(10): 2 – Keeling D., et al. Guidelines on the investigation and management of antiphospholipid syndrome. British Journal of Haematology 2012; 157(1): 47-58 3 - Ledford-Kraemer, M. R., et al. Laboratory testing for the lupus anticoagulant; Approved guideline. CLSI document H, 2014, 60

40 Jad żmii Russella jest silnym aktywatorem czynnika XdRVVT (diluted Russell’s viper venom time) – czas krzepnięcia osocza z rozcieńczonym jadem żmii Russella południowo – wschodnia Azja długość do 1,5 m najniebezpieczniejszy wąż tego regionu około 900 przypadków śmiertelnych rocznie Daboja łańcuszkowa (żmija łańcuszkowa) Jad żmii Russella jest silnym aktywatorem czynnika X

41 UFH i VKA – zaburzają wyniki testu.dRVVT (diluted Russell’s viper venom time) – czas krzepnięcia osocza z rozcieńczonym jadem żmii Russella UFH i VKA – zaburzają wyniki testu.

42 37oC ON OC dRVVT + Ca++ pomiar czasu dRVVT - zasada metodyDo badania stosujemy osocze ubogopłytkowe (np. po dwukrotnym wirowaniu). ON – osocze „normalne” OC – osocze chorego (badane)

43 Parametr Interpretacja dRVVT OC Ref: 30-40 sdRVVT - interpretacja (1) Parametr Interpretacja dRVVT OC Ref: s 0,9-1,05 – wartość prawidłowa > 1,05 – możliwy LA, trzeba wykluczyć niedobór czynników: II, V, X i fibrynogenu, lub inhibitora o innej naturze. dRVVT z dodatkiem fosfolipidów – „test neutralizacji”

44 dRVVT + PL - zasada metodyON OC dRVVT + Ca++ fosfolipidy 37oC pomiar czasu

45 dRVVT + PL – jak sprawdzić czy jest korekcja?Oblicz dRVVT RATIO Oblicz dRVVT + PL RATIO

46 dRVVT + PL – jak sprawdzić czy jest korekcja?Oblicz % korekcji Jeśli % korekcji > 10%, uznaje się, że doszło do korekcji czasu dRVVT co przemawia za obecnością LA

47