1 Spanish Human Proteome Project (sHPP). Proyecto SRM CIMA. María I. Mora, Fernando J. Corrales Laboratorio de Proteómica, CIMA, Universidad de Navarra

2 Proteína de interés Secuencia Datos MS/MS Crear Método MRM Péptidos proteotípicos Peptide verification Crear Método MRM “optimizado” Final Method Crear Método MRM “definitivo” (Scheduled) Transiciones Estrategia general *Adquirir *Evaluar *Optimizar!!! *Adquirir *Evaluar

3 20 proteínas asignadas a CIMA

4 Prueba preliminar en células Huh7 Preparación de la muestra a)Lisis: en Urea 7M / Thiourea 2M / CHAPS 4% / DTT 40mM b) Precipitación: cleanup kit (BioRad) Pellet resuspendido en Bicarbonato de Amonio 50mM PROBLEMA: Resuspensión!!!! c)Digestión: Reducción 10mM DTT, 56ºC, 30’ Alquilación 28mM IAA, RT, 20’ Digestión 1:50, 37ºC, o/n d)A QTRAP 5500: 1 ug / run

5 Transiciones: Definidas por MRM pilot 3 2 4 Ignore if: -KK/ KR/ RR/ RK (end) -end of sequence and 1

6 Métodos MRM individuales

7 Condiciones LC Pickup: 2ul Loading: 8min (3ul/min) Gradiente: 60 min (300nl/min)

8 Ejemplos MRMpilot Analyst Proteina: AARS Peptido: ALNEALK / 379.72 TR: 22.4’ y5 y6b6 b5 y4 b4 Programadas: 6 Observadas: 6

9 Programadas: 6 Observadas: 5 Analyst MRMpilot Proteina: TRIM72 Peptido: ILEAHVEAK / 505.29 TR: 20.6’ * y6 y7 y8 b8 y5

10 Analyst MRMpilot Proteina: TELO2 Peptido: FDRPLVTFDLLGED QLVLGR / 768.42 TR: 40.34’ Programadas: 5 Observadas: 5 y10 y7 y9 y8 y11

11 Proteina: SRRM2 Peptido: STTPAPK / 351.19 TR: 16.24’ Programadas: 5 Observadas: 5 Analyst y4 y5 y6 b6 b5

12 Analyst MRMpilot Proteina: CHD9 Peptido: TEEQVQK / 431.22 TR: 21.65’ Programadas: 5 Observadas: 4 b6 b5 y4 y5 !

13 Proteina: ARGHAP17 Peptido: DPVSAAVPAPGR / 568.81 TR: 19.85’ – 21.41’ MRMpilot Analyst y11 y7 y8 y5 y9 y10 y11 y7 y8 y5 y9 y10 Programadas: 6 Observadas: 6

14 Analyst Proteina: DNAJA2 Peptido: ENEVFQR / 472.73 TR: 16.3’ – 25.5’ y6 y5 y4 b6y4* b5 y6 y4 y5 b6 b5 * Programadas: 6 Observadas: 6 / 5 E en N- terminal

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16 Resultados MRM (peptide verification- I)

17 Resultados MRM (peptide verification- II)

18 Resultados MRM (peptide verification- III)

19 Proteína de interés Secuencia Datos MS/MS Crear Método MRM Péptidos proteotípicos Peptide verification Crear Método MRM “optimizado” Final Method Crear Método MRM “definitivo” (Scheduled) Transiciones Estrategia general *Adquirir *Evaluar *Optimizar!!! *Adquirir *Evaluar

20 Condiciones QTRAP 5500 MRM- Peptide Verification