1 Spektrometria mas

2 ZNACZĄCE POSTACIE SPEKTROMETRII MASIon Chemistry Francis William Aston ( ) Cambridge University, Great Britain; Nobel Prize in Chemistry 1922 1st MS Joseph John Thomson ( ) Cambridge University, Great Britain; Nobel Prize in Physics 1906 Ion Trap Technique Wolfgang Paul ( ) University of Bonn, Germany; Nobel Prize in Physics 1989 ESI of Biomolecules John B. Fenn (1917) Virginia Commonwealth University, Richmond, Virginia Fragmentation Mechanisms Fred W. McLafferty (1923) Cornell University Ithaca, New York Mechanisms and Applications R. Graham Cooks (1941) Department of Chemistry, Purdue University West Lafayette, Indiana Peptide Sequencing using MS Klaus Biemann (1926) MIT, Cambridge, Massachusetts MALDI Franz Hillenkamp (1936) University of Münster, Germany Mechanism of MALDI & ESI Michael Karas (1952) University of Frankfurt, Germany

3 Joseph Thompson: IZOTOPY HELU1911

4 ZASADA POWSTAWANIA WIDMA MASDroga jonów w polu elektrycznym i magnetycznym: rezultat działających sił: Siła pola magnetycznego (Fm) Siła odśrodkowa (Fc) Energia kinetyczna w polu elektrycznym (E) Fm = Bev B = natężenie pola magnetycznego Fc = mv2/r v = prędkość cząstki Ek = eU = ½ mv2 e = ładunek jonu m = masa cząstki r = promień toru U = natężenie pola elektrycznego Ek = energia kinetyczna cząstki

5 ZASADA POWSTAWANIA WIDMA MASFm = Fc Bev = mv2/r v = Ber/m

6 WIDMO MASOWE Stosunek masy jonu do jego ładunku w funkcjiintensywności sygnału Intensywność m/z 1 Th = 1 Dalton/liczbę ładunków

7 MASY ATOMOWE - IZOTOPY Węgiel 12C 12.0000* 98.89 13C 13.0033 1.11Symbol Masa atomowa Zawartość izotopu, % Węgiel C * 13C Chlor Cl 37Cl * Masa uznana jako dokładnie 12 przez UPAC M(C) = ( ) ( ) = M(Cl) = ( ) ( ) =

8 SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCH PIERWIASTKÓW12C (std) 98.89 13C 14N 15N 16O 17O 18O

9 SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCH PIERWIASTKÓW19F 28Si 29Si 30Si 32S 33S 34S 35Cl 37Cl

10 SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCH PIERWIASTKÓW79Br 81Br 126I M(Br): [% 79Br x ] + [% 81Br x ] [50.52 x ] + [49.48 x ] =

11 SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCHPIERWIASTKÓW

12 SKŁAD IZOTOPOWY – OBWIEDNIA IZOTOPOWAC1 C10 C100 m/z R.I. X X X X m/z R.I. X X m/z R.I. X X m/z

13 MASA CZĄSTECZKOWA MASA MONOIZOTOPOWAMasa cząsteczkowa respiryny C33H40N2O9 Masy atomowe: Masy izotopów: C: 33 x = C: 33 x = H: 40 x = H: 40 x = N: 2 x = N: 2 x = O: 9 x = O: 9 x =

14 PORÓWNANIE PROFILU IZOTOPOWEGOWIDMA ZMIERZONEGO I OBLICZONEGO

15 WIDMO MAS A STRUKTURA MOLEKUŁY

16 Jonizacja cząsteczek wiązką elektronówRODZAJE JONIZACJI Miękka Jonizacja cząsteczek wiązką elektronów Twarda

17 METODY JONIZACJI

18 WIDMO EI KWASU OCTOWEGO

19 ZALEŻNOŚĆ STOPNIA FRAGMENTACJIOD SIŁY POLA ELEKTRYCZNEGO

20 ESI 5kV LC Desolvation & Fission Droplet Formation Gas Phase IonOrifice Plate LC 5kV Desolvation & Fission Nebulizing Gas Droplet Formation To MS Gas Phase Ion Generation Drying Gas Curtain Plate Curtain Gas

21 REDUKCJA KROPLI I POWSTAWANIE JONÓW

22 ESI Tryb jonów dodatnich Tryb jonów ujemnych [M+H]+ [M-H]-[M+nH]n+ i [M+Na+]+ [M-nH]n- i [M+I-]-

23 ESI Potrójny Kwadrupol (QqQ) 2 kwadrupole filtrujące masy i jedna cela zderzeń. Pułapka jonowa (IT) Pojedyncza pułapka działa jako analizator mas i cela zderzeń. Hybrydy (np. LIT) Instrument wygląda jaki QqQ ale jeden kwadrupol pełni rolę pułapki jonów.

24 POTRÓJNY KWADRUPOL Akumulacja jonów Q0 Q1 Q2 Q3 Filtrowanie jonówCela zderzeń Filtrowanie jonów

25 Q2 fragmentuje wyselkcjonowany jon. POTRÓJNY KWADRUPOL Ion accumulation Q0 Q1 Q2 Q3 Precursor ion selection Fragmentation N2 CAD Gas Q1 selkcjonuje [M+H]+ Q2 fragmentuje wyselkcjonowany jon. Q3 filtruje i monitoruje tylko wybrany jon.

26 WIDMO ESI ZWIĄZKU O NISKIEJ MASIE

27 WIDMO ESI SYNTETYCZNEGOOLIGONUKLEOTYDU

28 WIDMO ESI KOMPLEKSÓW 18-C-6Z KATIONAMI LITOWCÓW

29 WIDMO ESI PEPTYDU O MASIE 16952,20 Da

30 ROZDZIELCZOŚĆ SPEKTROMETRU MAS

31

32 FRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGO

33 FRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGOb2-H2O b3- NH3 a2 b2 a3 b3 HO NH3+ | | R O R2 O R O R4 | || | || | || | H -- N --- C --- C --- N --- C --- C --- N --- C --- C --- N --- C -- COOH | | | | | | | H H H H H H H y3 y2 y1 y2 - NH3 y3 -H2O

34 FRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGO

35 IDENTYFIKACJA PEPTYDÓW/BIAŁEK PRZY UŻYCIU MS/MSG V D L K Identyfikacja peptydu MS/MS mass Intensity mass

36 TANDEM MS

37 Peptide Mass Fingerprinting (PMF)„ODCISK PALCA” W MS Peptide Mass Fingerprinting (PMF)

38 PROTEOMIKA - MS Trypsin + Gel punch p53 Trx G6PDH

39 ENZYMATYCZNA HYDROLIZA BIAŁEK DO PEPTYDÓWGTDIMR HPLC do MS/MS PAKID MPSERGTDIMRPAKID...... MPSER …… …… PEPTYDY (tryptic peptides) BIAŁKO

40 BIBLIOTEKA PEPTYDÓW TRYPTYCZNYCHSekwencja Masa (M+H) Peptydy trypt. >Białko 1 acedfhsakdfqea sdfpkivtmeeewe ndadnfekqwfe >Białko 2 acekdfhsadfqea nkdadnfeqwfe >Białko 3 MASMGTLAFD EYGRPFLIIK DQDRKSRLMG LEALKSHIM A AKAVANTMRT SLGPNGLD KMMVDKDGDVTV TNDGAT ILSM MDVDHQIAKL MVELS KSQDD EIGDGTTGVV VLAG ALLEEAEQLLDRGIHP IRIAD acedfhsak dfgeasdfpk ivtmeeewendadnfek gwfe acek dfhsadfgeasdfpk ivtmeeewenk dadnfeqwfe SQDDEIGDGTTGVVVLAGALLEEAEQLLDR2 DGDVTVTNDGATILSMMDVD HQIAK MASMGTLAFDEYGRPFLIIK2 TSLGPNGLDK LMGLEALK LMVELSK AVANTMR SHIMAAK GIHPIR MMVDK DQDR

41 TANDEM MS MS LC Ion Source MS-1 collision cell MS-2 MS/MS

42 ANALIZA DANYCH S e kwencja MS/MS instrument Analiza przy użyciu baz danych

43 PMF online Mascot ProFound MOWSE PeptideSearch PeptIdent ProFound MOWSE PeptideSearch PeptIdent