1 Sterowanie metabolizmem

2 Sterowanie metabolizmemWydajna produkcja metabolitu Zakłócenie procesów metabolicznych Przejściowe Trwałe zmiana warunków modyfikacja środowiska genotypu

3 Sterowanie metabolizmemZmiany warunków środowiskowych Indukcja substratowa i represja kataboliczna Represja produktami reakcji enzymatycznych Zwiększenie przepuszczalności osłon komórkowych Zmiana preferencji metabolicznych Dodatek prekursorów Regulacja źródłem węgla Regulacja związkami azotu Regulacja fosforanowa Regulacja parametrami fizyko-chemicznymi temperaturą pH natlenianiem

4 Sterowanie metabolizmemModyfikacje genotypu Zmiana aktywności enzymów Mutanty auksotroficzne Mutanty regulatorowe Szczepy otrzymywane metodami inżynierii genetycznej

5 Indukcja substratowa i represja katabolicznaIndukcja substratowa – umożliwia syntezę określonych enzymów wyłącznie w obecności odpowiedniego substratu lub jego strukturalnego analogu Represja kataboliczna – obecność łatwo przyswajalnego substratu hamuje syntezę enzymów potrzebnych do przyswajania innych potencjalnych substratów Represja kataboliczna jest mechanizmem dominującym

6 Indukcja substratowa i represja katabolicznaDegradacja substratów wielkocząsteczkowych Przyswajanie związków małocząsteczkowych Enzym Zastosowanie przemysłowe Indukcja substratowa Represja kataboliczna β-galaktozydaza przemysł mleczarski laktoza, IPTG glukoza amyloglukozydaza przetwórstwo skrobi skrobia, dekstryny glukoza, laktoza, kwas glutaminowy α-amylaza maltotetroza izomeraza glukozowa ksyloza, ksylan IPTG – izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozyd

7 Indukcja substratowa i represja katabolicznaBrak represji katabolicznej nie wystarcza do syntezy białek, jeżeli nie ma induktora Obecność induktora nie wystarcza do syntezy białek, jeżeli jest represja Synteza białek zachodzi jedynie w obecności induktora i przy braku represji katabolicznej R – represor B1, B2, B3 – białka biorące udział w metabolizmie substratu A – struktura regionu regulatorowego

8 Indukcja substratowa i represja katabolicznaMechanizm często wykorzystywany przy konstrukcji systemów ekspresyjnych E. coli

9 Przemysłowa produkcja aminokwasów

10 Przemysłowa produkcja aminokwasówAminokwasy egzogenne Fenyloalanina Izoleucyna Leucyna Lizyna Metionina Treonina Tryptofan Walina Asparagina Histydyna Kwas glutaminowy ??? Ponad 50% rocznej produkcji aminokwasów Glutaminian sodu – wzmacniacz smaku Składnik przypraw i żywności w proszku

11 Produkcja kwasu glutaminowegoCorynebacterium glutamicum Gram + Morfologicznie zmienne krótkie pałeczki maczugowce ziarniaki Tlenowe lub względnie beztlenowe Optymalna temp °C Wykazują auksotrofię biotynową

12 Produkcja kwasu glutaminowegoWydajna produkcja wymaga usuwania kwasu glutaminowego z komórki Zwiększenie przepuszczalności osłon komórkowych deficyt biotyny nadmiar nasyconych kwasów tłuszczowych detergenty antybiotyki hamujące syntezę peptydoglikanu ściany komórkowej Zmiana warunków środowiskowych

13 Produkcja kwasu glutaminowegoWydajna produkcja wymaga usuwania kwasu glutaminowego z komórki Zwiększenie przepuszczalności osłon komórkowych auksotrofia glicerolowa auksotrofia oleinowa Mutanty auksotroficzne

14 Produkcja lizyny Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavumZmiana preferencji metabolicznych - hamowanie jednego z odgałęzień szlaku metabolicznego przez nadmiar produktu tego odgałęzienia 1 – syntaza dihydropikolinianowa 2 – dehydrogenaza homoserynowa 3 – transacylaza homoserynowa 4 – dehydrataza homoserynowa

15 Produkcja lizyny Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavumMutanty auksotroficzne Hser- Kinaza asparaginianowa (7) produkowana jest konstytutywnie Podlega regulacji allosterycznej w obecności L-lizyny i L-treoniny (jednoczesny nadmiar obu aminokwasów) Mutacja dehydrogenazy homoserynowej (8) znosi negatywną regulację kinazy asparaginianowej

16 Produkcja penicyliny Prekursory Enzymy L-cysteina L-walinaKwas L-α-aminoadypinowy Enzymy syntetaza L-α-aminoadypinoilo-L-cysteinylo-D-waliny (syntetaza ACV) syntaza izopenicyliny N (syntaza IPN) Acylaza penicylinowa Acylotransferaza izopenicyliny N

17 Regulacja źródłem węglaProdukcja penicyliny przez Penicillium chrysogenum Wymaga zniesienia ogólnometabolicznego układu represji katabolicznej Decyduje nie rodzaj źródła węgla, ale szybkość jego metabolizmu Represja kataboliczna synteza kwasu L-α-aminoadypinowego (L-α-AA) synteza syntetazy L-α-aminoadypinoilo-L-cysteinylo-D-waliny (syntetazy ACV) synteza syntazy izopenicyliny N (syntazy IPN)

18 Regulacja fosforanowaProdukcja penicyliny przez Penicillium chrysogenum Wymaga zniesienia ogólnometabolicznego układu represji katabolicznej Nadmiar jonu fosforanowego pogłębia efekt represji katabolicznej stymuluje transport glukozy do komórki stymuluje metabolizm glukozy

19 Regulacja związkami azotuProdukcja penicyliny przez Penicillium chrysogenum Wymaga obecności glutaminy jako donora grupy aminowej w syntezie aminokwasowych prekursorów penicyliny Nadmiar jonu amonowego powoduje represję syntetazy glutaminowej

20 Produkcja penicyliny G przez Penicillium chrysogenumDodatek prekursorów Produkcja penicyliny G przez Penicillium chrysogenum Selektywna produkcja penicyliny G wymaga dodatku prekursora reszty benzylowej fenylooctanu fenyloalaniny

21 Mutanty regulatorowe mutageneza sekwencji operatorowychmutageneza genów kodujących białka regulatorowe (represory) mutageneza sekwencji operatorowych mutageneza genów kodujących enzymy allosteryczne