1 T-DNA Mutagenesis: From Tagging to Insertion Sequence DatabasesLuis Destefano-Beltrán

2 Mutagénesis del T-DNA Introducción Mecanismo de TransferenciaDesarrollo de protocolos de transformacion De una poblacion de mutantes de inserción a un archivo de etiquetas de secuencia flanqueando al T-DNA

3 Agallas & AgrobacteriumPor siglos los agricultores observaron la presencia de agallas en las base de algunos árboles frutales. Smith & Towsend en 1907 descubrieron al Agrobacterium tumefaciens En los ’30s y ’40s se demostró que una vez que la neoplasia era inducida ya no se necesitaba la presencia de A.t. para el crecimiento sostenido. Esto sugirió la transmisión de un factor inductor de la bacteria a la planta A comienzos de los ’70s se identificó la presencia de un gran plásmido extracromosómico al que se bautizó como el plasmido Ti (tumor-inducing)

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6 Cont En 1977, Chilton et al. demostraron que una porción del Ti, que llamaron el T-DNA (transfer-DNA), era transferido a los tejidos vegetales que presentaban crecimiento neoplásico. Unico organismo que participa, además de algunos virus, en la transferencia de material genético de un reino a otro reino (hongos, celulas humanas). En los siguientes 30 años se han hecho muchos avances en los detalles a nivel molecular del proceso de transferencia del T-DNA a la planta.

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21                        Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Clough SJ, Bent AF. Department of Crop Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign 61801, USA.

22 Aislamiento de genes de una colección de mutantes por inserciónAnálisis de cosegregación entre el fenotipo y el T-DNA Aislamiento del gen es facilmente obtenido usando: plasmid rescue IPCR, TAIL PCR

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33 T-DNA Insertion CollectionsSIGNAL Col-O, pROK2, LB, 141,486 FSTs SAIL Col-O, pDAP101, LB, 100,000 GABI-Kat Col-O, pAC106, LB & RB, 42,ooo Versailles collection Ws, pGKB5, LB, 29,000

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35 presentan inserciones de T-DNAAl comparar las diferentes bases de datos se encuentran aprox. 4,973 que no presentan inserciones de T-DNA

36 Diagrama de Venn indicando el número de genes “únicos” en cadacolección

37 Genes sin el soporte de EST/cDNA están enriquecidos en el conjunto degenes sin inserción