1 TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA

2 Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Las enzimas de restricción. Aislamiento de ADN foráneo. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector/ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Obtención de genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

3 1. Introducción: la clonación molecularLa clonación consiste en la obtención de un clon, entendido como un conjunto de elementos genéticamente iguales entre si e iguales a su precursor. - Amplificación de moléculas de ADN por clonación célular Amplificación de moléculas de ADN por clonación acelular (PCR) - Manipulación genética y clonación de organismos pluricelulares (animales y plantas)

4 1. Introducción: la clonación molecular... ¡¡ Dios mío, me han clonado... !!

5 1. Introducción: la clonación molecularEstrategia general del proceso de clonación Extraer el gen de interés insulina

6 Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Las enzimas de restricción. Aislamiento de ADN foráneo. 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector/ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Obtención de genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

7 Plásmidos bacterianos1. Introducción: la clonación molecular Aislamiento y digestión del ADN Herbert Boyer (Unversidad de Columbia) Enzimas restricción Inserción en moléculas vectores Stanley Cohen (Universidad de Stanford) Plásmidos bacterianos . con capacidad autónoma de replicación en la célula hospedadora

8 2. Las enzimas de restricciónFosfodiesterasa de veneno de serpiente Los ácidos nucleicos son hidrolizados por nucleasas Exonucleasas: atacan por un extremo determinad de la cadena nucleotídica exonucleasa a o 3’ exonucleasa b o 5’ Endonucleasas: atacan de forma selectiva una secuencia nucleotídica Enzimas de restricción

9 EcoRI actuando sobre una secuencia de ADN2. Las enzimas de restricción EcoRI actuando sobre una secuencia de ADN

10 1. Introducción: la clonación molecularEstrategia general del proceso de clonación 1. Aislamiento del ADN foráneo 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector-DNA foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

11 Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

12 1. Introducción: la clonación molecular1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector 1. Introducción: la clonación molecular Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector- ADN foráneo en la célula hospedadora Cortar el ADN foráneo y el vector con las mismas enzimas de restricción 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

13 2. Aislamiento del ADN foráneo. EndonucleasasMétodos de aislamiento de ADN foráneo (a) Endonucleasas de restricción Tipos I, II, III EcoRI

14 2. Aislamiento del ADN foráneo. EndonucleasasTipo I y Tipo III  Actividad restricción y modificación  Precisan Mg 2+, ATP y S-adenosil-metionina  Reconocen una secuencia específica  Recorren un cierto número de bases y cortan Tipo II  Rompen por la secuencia de reconocimiento  Precisan Mg 2+, pero no ATP

15 2. Las enzimas de restricciónLos ácidos nucleicos son hidrolizados por nucleasas Ejemplos de endonucleasa extremos cohesivos 5’ 3’ G↓A A T T C C T T A A↑G 3’ 5’ C C G G G G C C extremos romos

16 Secuencias Palindrómicas2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas Acción de endonucleasas de restricción Tipo II: corte ADN EcoR 1 de E.coli G A A T T C Secuencias Palindrómicas C T T A A G A A G C T T Hind III de T T C G A A Haemophilus influenza

17 Secuencias Palindrómicas2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas Acción de endonucleasas de restricción Tipo II: corte ADN EcoR 1 de E.coli Secuencias Palindrómicas G A A T T C Extremos cohesivos C T T A A G

18 G A A T T C C T T A A G A A T T C G G C T T A A2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas EcoR 1 de E.coli G A A T T C C T T A A G A A T T C G G C T T A A Extremos pegajosos

19 2. Aislamiento del ADN foráneo. EndonucleasasExtremos cohesivos Extremos romos

20 2. Aislamiento del ADN foráneo. EndonucleasasMétodos de aislamiento de ADN foráneo (a) Cortes: Endonucleasas de restricción (Tipos I, II, III) Fragmentación mecánica Síntesis de DNA a partir de RNAm: Transcriptasa reversa Síntesis química directa (b) Síntesis

21 Transcriptasa reversa2. Aislamiento del ADN foráneo. Endonucleasas Síntesis de ADN a partir de ARNm Transcriptasa reversa ADN cDNA transcripción ARN polimerasa Transcriptasa reversa ARN traducción PROTEÍNA RNA La mayoría de las células Retrovirus RNA

22 2. Aislamiento del ADN foráneo. EndonucleasasSíntesis de ADN a partir de ARNm Transcriptasa reversa

23 Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

24 1. Introducción: la clonación molecular1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector 1. Introducción: la clonación molecular Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector- ADN foráneo en la célula hospedadora Vector de clonación Cortar el ADN foráneo y el vector con las mismas enzimas de restricción 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

25 Características principales3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Vectores de clonación Son vehículos de ADN para ADN, capaces de recibir ADN foráneo y replicarlo. Características principales Se replican de forma autónoma (origen de replicación) Contienen regiones no esenciales para su multiplicación y estabilidad

26 Contienen genes de resistencia a antibióticos. Virus 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Tipos de vectores: Plásmidos Permiten insertar hasta 20 kb de ADN pero son más eficaces con insertos más pequeños (<10kb). Contienen genes de resistencia a antibióticos. Virus Permiten insertar kb. El sistema de infección del virus permite la entrada del ADN en E. coli. Los virus de cadena sencilla tienen aplicaciones especiales para secuenciar y realizar mutagénesis. Vectores híbridos: cósmidos. Permiten insertar hasta 40 kb.

27 Tipos de vectores de clonación3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Tipos de vectores de clonación Plásmidos (bacterianos) Virus Cósmidos (laboratorio) YACs (levaduras)

28 Plásmidos 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN ADNADN Plasmídico ADN pBR322 -Control relajado -Fenotipo seleccionable -Cierto Nº de sitios de restricción -Bajo PM (4 363 bp) (transformación con plásmidos bp es poco eficiente

29 Tipos de vectores de clonación3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Tipos de vectores de clonación Plásmidos (bacterianos) Virus Cósmidos (laboratorio) YACs (levaduras)

30 Para bacterias: Fago l y derivados, Fago M13 Para plantas: CaMV 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Virus: se emplea como vector, junto con la capacidad que poseen para introducir el ADN foráneo en la célula hospedadora Para bacterias: Fago l y derivados, Fago M13 Para plantas: CaMV Para mamíferos: SV40

31 Fago l Virus 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN-El corte por los sitios cos y el empaquetamiento en la cápsida puede hacerse in vitro. La cápsida admite entre 38 y 53 Kb (-20% y + 10% del DNA l). Se introduce en la bacteria hospedadora por transducción

32 Adsorción de particulas virales a una bacteria

33 SIDA

34 Tipos de vectores de clonación3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN Tipos de vectores de clonación Plásmidos (bacterianos) Virus V Cósmidos (laboratorio) Mezcla plásmido y virus YACs (levaduras), contienes sitios característicos de la funcionalidad de los cromosomas

35 Un plásmido que posee el sito cos del fago l,3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN COSMIDO Un plásmido que posee el sito cos del fago l,

36 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADNVector YAC Levaduras 1000 kb

37 Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

38 1. Introducción: la clonación molecular1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector Vector de clonación 3.Introducción del vector- ADN foráneo en la célula hospedadora Cortar el ADN foráneo y el vector con las mismas enzimas de restricción 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

39 1. Introducción: la clonación molecular1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector 1. Introducción: la clonación molecular Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector- ADN foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

40 Formación de ADN recombinante: unión ADN foráneo-vector3. Vectores de clonación y unión del framento de ADN Formación de ADN recombinante: unión ADN foráneo-vector

41 Enzimas de restricción3. Vectores de clonación y unión del framento de ADN Enzimas de restricción Vector ADN

42 Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

43 1. Introducción: la clonación molecular1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector 1. Introducción: la clonación molecular Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector- ADN foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

44 4. Hospedadores. Introducción del ADN foráneoMétodos de inserción del ADN-vector en célula huesped Transformación: ADN plasmídico en célula. CaCl2 (mejora el proceso). Para plásmidos < 20 Kb Infección: directa del virus empaquetado in vitro Transducción: ADN vírico sin cápsida (menor rendimiento) Microinyección: para células grandes (eucariotas) con micromanipulación. Pistola o Bombardeo de partículas: para transformar vegetales. Conjugación: celular del ADN de dos células Fusión de Protoplastos: intercambio ADN, dos células sin pared celular W, Au

45 Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

46 1. Introducción: la clonación molecular1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector 1. Introducción: la clonación molecular Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector- ADN foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

47 5. Métodos de selección MÉTODOS DE SELECCIÓN Resistencia a antibióticos Genes marcadores (gen b-galactosidasa) GFP (green fluorescent protein) Hibridación de colonias

48 Resistencia a antibióticos5. Métodos de selección Resistencia a antibióticos La resistencia la confieren genes que porta el vector, en este caso a ampicilina y a tetraciclina El ADN foráneo se inserta en el gen de resistencia a Ampicilina Plásmido pBR322

49 Resistencia a antibióticos5. Métodos de selección Resistencia a antibióticos La resistencia la confieren genes que porta el vector Sin plásmido Sin inserto Con plásmido Con inserto Con plásmido Sin inserto Con ampicilina y tetraciclina Con tetraciclina

50 5. Métodos de selección MÉTODOS DE SELECCIÓN Resistencia a antibióticos Genes marcadores (gen b-galactosidasa) GFP (green fluorescent protein) Hibridación de colonias

51 5-Br-4-Cl-3-indolil-b-galactósido  Br-Cl-indol + galactosa5. Métodos de selección Amp Gal Ori pUC19 Genes marcadores (ej: gen b-galactosidasa) 5-Br-4-Cl-3-indolil-b-galactósido  Br-Cl-indol + galactosa (X-gal) (Azul) Inactivación insercional (introducir el DNA foraneo en el medio del marcador) Inserción génica positiva (Unir el gen marcador al DNA foraneo)

52 5. Métodos de selección Genes marcadores (gen b-galactosidasa) Gal + inserto Plasmido pUC19 Amp Gal Ori Amp Ori Plasmido pUC19

53 5. Métodos de selección Genes marcadores b-galactosidasa

54 X 5. Métodos de selección pUC19 = plásmidob-galactosidasa + ADN foráneo pUC19 = plásmido b-galactosidasa X

55 5. Métodos de selección MÉTODOS DE SELECCIÓN Resistencia a antibióticos Genes marcadores (gen b-galactosidasa) GFP (green fluorescent protein) Hibridación de colonias

56 5. Métodos de selección GFP (green fluorescent protein)

57 GFP (green fluorescent protein)5. Métodos de selección GFP (green fluorescent protein) 510 488 Tubulina GFP-TUB 530 515 Retículo endoplásmico YFP-ER Peroxisomas GFP-PEROXI Núcleo YFP-NUC 475 420 Mitocondria CFP-MITO 600 550 RFP-MITO Membrana M-GFP Endosomas GFP-ENDO Ap. De Golgi CFP-GOLGI Actina GFP-ACTIN Emisión (nm) Excitación (nm) Localización Vector

58 1. Introducción: la clonación molecular1. Aislamiento del ADN foráneo y del ADN vector 1. Introducción: la clonación molecular Estrategia general del proceso de clonación 2. Unión del fragmento de ADN foráneo a un vector 3.Introducción del vector- ADN foráneo en la célula hospedadora 4. Selección de los transformantes 5. Estabilidad de la información genética

59 Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

60 Genotecas Genoteca: colección de clones que contiene todo el genoma de un organismo. Tipos de genotecas: Genómicas Parciales ADNc. Colección de ARNm Tipos de vectores: Plásmidos (Genotecas parciales) Fagos (Genotecas genómicas pequeñas y de ADNc) Cósmidos, BAC (genotecas genómicas complejas)

61 Utilizando un plásmido6. Obtención de genotecas Utilizando un virus Utilizando un plásmido

62 Hibridación de colonias5. Métodos de selección Hibridación de colonias Consiste en detectar secuencias de DNA en colonias transformadas mediante hidridación “in situ” con sondas marcadas Obtención de la sonda marcada: marcaje radioactivo: (32P) marcaje desoxinucleótidos fluorescentes

63 Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

64 7. Electroforesis en geles de agarosa

65 TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS Se basan en la migración diferencial de las moléculas a separar en un campo eléctrico.  Generalmente se lleva a cabo en un soporte inerte. (AGAROSA)  En la electroforesis en gel la fuerza que provoca la migración de las moléculas es el campo electrico, pero el gel actúa como filtro molecular, relentizando la migración su migración en función de su tamaño

66 7. Electroforesis en geles de agarosa

67 - Geles de acrilamida (proteínas, geles de secuenciación de ADN)ELECTROFORESIS. SOPORTES - Geles de acrilamida (proteínas, geles de secuenciación de ADN) Gelificación química - Geles de agarosa (los más usuales para ADN) Gelificación térmica

68 ELECTROFORESIS DE ADN  Disolver la agarosa a la concentración deseada en una solución salina TAE (Tris-acetato-EDTA) o TBS mediante calentamiento  Dejar enfriar hasta unos 50ºC y añadir Bromuro de Etidio Bromuro de Etidio

69 7. Electroforesis en geles de agarosaLa agarosa es el polímero usado para la separación.

70 7. Electroforesis en geles de agarosaLa agarosa se mezcla con un tampón.

71 7. Electroforesis en geles de agarosaLa agarosa se disuelve en el microondas.

72 7. Electroforesis en geles de agarosaSe preparan la cubeta y el peine.

73 7. Electroforesis en geles de agarosaSe añade el polímero disuelto a la cubeta y se espera hasta su gelificación.

74 7. Electroforesis en geles de agarosa El gel se coloca en una cubeta de electroforesis y se cubre con solución TAE Se procede a cargar los pocillos con las muestras Se procede a conectar a una fuente de electroforesis

75 7. Electroforesis en geles de agarosaFormados los “pocillos”, se coloca en ellos cada muestra, incluidos los patrones.

76 7. Electroforesis en geles de agarosaCada muestra forma una banda azul que “correrá” en la agarosa dependiendo de su tamaño.

77 7. Electroforesis en geles de agarosa El gel se coloca en una cubeta de electroforesis y se cubre con solución TAE

78 7. Electroforesis en geles de agarosaEl gel se retira y el bromuro de etidio ligado al ADN se visualiza con transiluminador de UV, apareciendo bandas fluorescentes. Se coloca el gel en un transiluminador de luz UV Se visualizan las bandas de ADN teñidas con el bromuro de etidio.

79 7. Electroforesis en geles de agarosa La movilidad electroforética del ADN en los geles de agarosa es inversa a su tamaño

80 Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

81 8. PCR (Polymerase Chain Reaction)

82 Kary Mullis. Premio Nobel de Química en 19938. PCR (Polymerase Chain Reaction) Kary Mullis. Premio Nobel de Química en 1993 Descrubrió la PCR en 1985, cuando trabajaba para Cetus Corp. ”Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an afternoon”

83 8. PCR (Polymerase Chain Reaction)PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA. DNA (molécula sencilla) PCR amplificación Muchas moleculas del mismo ADN

84 8. PCR (Polymerase Chain Reaction)PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA. Controlando la temperatura DNA (doble hélice)

85 Síntesis por DNA polimerasa8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9 Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G Cortos primers de DNA específicos que hibridan con la cadena que tiene que ser copiada los dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

86 Síntesis por DNA polimerasa8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9 Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T

87 Síntesis por DNA polimerasa8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9 Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A

88 Síntesis por DNA polimerasa8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9 Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C

89 Síntesis por DNA polimerasa8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9 Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G

90 Síntesis por DNA polimerasa8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9 Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G T

91 Síntesis por DNA polimerasa8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9 Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G T A

92 8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9Después del primer periodo de síntesis de DNA, tenemos copiada una cadena de DNA Primer 1 Extensión de la cadena Cadena original de DNA ¿Cómo produce este proceso una AMPLIFICACIÓN?

93 8. PCR (Polymerase Chain Reaction)Tema 9 Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (90 ~ 100°C)

94 8. PCR (Polymerase Chain Reaction)Tema 9 Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (90 ~ 100°C) Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva cadena con la DNA polimerasa 2 1 Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente, dado que hay un exceso de Primer 1 Ahora tenemos dos copias de la molécula original

95 8. PCR (Polymerase Chain Reaction) Tema 9Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura Fusión 95°C Hibridización 50-60ºC Extensión de La cadena 75ºC 2do Ciclo 95ºC ºC 75ºC Primer Ciclo Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias Múltiples ciclos darán un incremento exponencial de copias

96 para amplificar los sandwiches?8. PCR (Polymerase Chain Reaction) ADN-polimerasa de Thermus aquaticus (Taq –polimerasa) Parque Nacional de Yellowstone Hey, Boo Boo ¿pescamos lasTap para amplificar los sandwiches? Ok Yogy

97 8. PCR (Polymerase Chain Reaction)

98 8. PCR (Polymerase Chain Reaction)Pelo humano

99 Indice 1. Introducción: la clonación molecular 2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introducción del vector-ADN foráneo 5. Métodos de selección 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR

100 METODO DE SANGER PARA LA SECUENCIACIÓN DE DNA8. Métodos de secuenciación del ADN METODO DE SANGER PARA LA SECUENCIACIÓN DE DNA U K J

101 TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN GENÉTICA