1 TÉCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN EL DIAGNÓSTICO GENÉTICO ITÉCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN EL DIAGNÓSTICO GENÉTICO I. Mapas de restricción. Marcadores moleculares: RFLP, SSLP, VNTR (minisatélites y microsatélites), SNP. Secuenciación. Hibridación. Obtención de sondas. Transferencia Northern y Southern. ADNc. PCR. Microarray.

2 TÉCNICAS DE GENÉTICA MOLECULARFRAGMENTACIÓN DEL ADN CLONACIÓN AMPLIFICACIÓN DEL ADN SECUENCIACIÓN DEL ADN HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

3 FRAGMENTACIÓN DEL ADN

4

5 CLONACIÓN EN PROCARIOTASAislar y multiplicar en tubo de ensayo un determinado gen o, en general, un trozo de ADN

6

7 CLONACIÓN DEL ADN

8 Vector recombinante con el inserto 1 o 2ADN donante Vector recombinante con el inserto 1 o 2

9 IDENTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS RECOMBINANTESRESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS: El plásmido que contiene el gen de la proteína de interés también contiene un gen de resistencia a un antibiótico BACTERIAS “COLOREADAS”: El gen de nuestra proteína se inserta en el plásmido interrumpiendo al gen de una enzima que produce color azul

10 ELECTROFORESIS

11 ELECTROFORESIS

12 ELECTROFORESIS

13 TIPOS DE GELES POLIACRILAMINA: para fragmentos de ADN menores de 500 nucleótidos AGAROSA: para fragmentos de ADN mayores de 500 nucleótidos CAMPO PULSANTE (agarosa): fragmentos grandes de ADN, incluso cromosomas completos

14 MAPAS DE RESTRICCIÓN

15 MAPAS DE RESTRICCIÓN

16 PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

17 SECUENCIACIÓN DE UN FRAGMENTO PURIFICADO DE ADN* Método Enzimático de Sanger * Método Químico de Maxam y Gilbert

18 MÉTODO ENZIMÁTICO DE SANGER

19 MÉTODO ENZIMÁTICO DE SANGERSíntesis in vitro de ADN en presencia de nucleótidos trifosfato terminadores de cadena Secuenciador Automático (+700 nt) A C G T Autorradiografía (300 nt) A C G T

20 CROMATOGRAMA DE SECUENCIA

21 MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT

22 HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOSLa hibridación se produce sólomente entre cadenas complementarias ADN-ADN, ADN-ARN, ARN-ARN, La propiedad de los ácidos nucleicos para hibridar solo con secuencias complementarias proporciona un método muy valioso para encontrar secuencias concretas

23 HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOSSONDA: secuencia conocida de ADN o de ARN que es complementaria a la secuencia de interés y que se apareará con ella; se utiliza para localizar secuencias específicas de ADN

24 SONDAS Marcaje de fragmentos de ADN: sondas altamente marcadassondas marcadas en 5´ Tipo de marcaje: radiactivo: p32 químico: fosfatasa alcalina, biotina, etc.

25 SONDAS Marcaje de fragmento de DNA (Obtención de sondas):Altamente Marcadas Marcadas en 5´ Marcaje de fragmento de DNA (Obtención de sondas): Sondas altamente marcadas o marcadas en 5´. Marcaje radiactivo o químico.

26 ADNc

27 En un corte histológico para detectar la expresión de un gen concretoEn un corte histológico para detectar la expresión de un gen concreto. Localiza los ARNm en las posiciones precisas que ocupan en las células o tejidos Hibridación “in situ”

28 Hibridación “in situ” con fluorescenciaFISH

29 SOUTHERN BLOT

30 Microarrays

31 MARCADOR MOLECULAR Sitio de heterocigosidad de ADN, no asociado necesariamente a una variación fenotípica, que se utiliza como una etiqueta de un locus cromosómico particular SNP (polimorfismo de un solo nucleótido): sustitución de un nucleótido por otro SSLP (polimorfismos en la longitud de secuencias simples): variación en el tamaño del fragmento por inserción/deleción VNRT (número variable de repeticiones en tándem): Minisatétiles (centrómeros y telómeros) Microsatétiles (distribuidos por todo el genoma)

32 LOS POLIMORFISMOS SE COMPORTAN COMO ALELOS (dos alelos por individuo)RFLP (polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción): Método para la detección de los distintos polimorfismos, mediante la utilización de enzimas de restricción LOS POLIMORFISMOS SE COMPORTAN COMO ALELOS (dos alelos por individuo)

33 DETECCIÓN DE SNPs MEDIANTE RFLP1, 1 1, 2 2, 2 1 ER ER ER 2 SNP

34 DETECCIÓN DE SNPs MEDIANTE RFLP1, 1 1, 2 2, 2 1 ER ER ER 2 SNP

35 PADRE MADRE HIJO Padre Madre Hijo

36 DETECCIÓN DE VNTR MEDIANTE RFLP1 ER ER ER ER 1 2 ER ER 2 ER ER

37 VNTR-microsatélites (2-5 pb)