1 Técnicas para el estudio de expresión de genesHibridación sustractiva SAGE ADNc – AFLP DDRT – PCR Arrays de ADN Tratamiento con bisulfito Northern Blot RPA RT-PCR Hibridación In Situ Estudio de la expresión global Epigenética Expresión de genes específicos

2 (Chips o Disposiciones de ADN)Arrays de ADN (Chips o Disposiciones de ADN)

3 Tipos de arrays Arrays de ADN Microarrays Gene-chip®Chips microelectrónicos Macroarrays Arrays de Tejidos

4 ¿Qué es un array de ADN? Un array es un conjunto de sondas moleculares de composición conocida fijadas de manera ordenada sobre un soporte sólido. Estas sondas pueden ser clones de ADN, productos de PCR o bien oligonucleótidos sintéticos.

5 Microdisposiciones de ADN o MicroarraysMicroarray de ácidos nucleicos Microdisposiciones de ADN o Microarrays Tecnología basada en capacidad de hibridación de los ácidos nucleicos PERO ENTONCES… ¿QUÉ DIFERENCIA EXISTE ENTRE UN MICROARRAY Y EL NORTHERN BLOT?

6 Hibridación Procedimiento experimental1.La hélice de doble cadena (ADN) es separada mediante un proceso físico (calor) o químico, rompe los enlaces por puente de hidrógeno que mantienen unidas las dos hebras del ADN. 2.Las dos hebras complementarias se separan, el ADN se desnaturaliza. 3.Una muestra de cadenas simples (o desnaturalizadas) se mezcla con otra muestra de cadenas simples marcadas (sonda). 4. En la muestra combinada las moléculas sencillas se van uniendo por las zonas complementarias y se va formando una nueva molécula hibridada.

7 Microarray Northern BlotSonda fijada sobre un soporte La muestra se marca y se agrega Se fijan distintas sondas para varios genes. Evalúa la expresión de varios genes en dos muestras a la misma vez. Muestra fijada sobre un soporte La sonda se marca y se agrega Se utiliza una sonda para un gen. Evalúa la expresión de un gen en una sola muestra.

8 ejemplo: comparación de expresión de RNAPasos a seguir… ejemplo: comparación de expresión de RNA Pasos a seguir… Adquirir el soporte (“comprar”) Aislar RNA de células ó muestras de tejidos Convertir RNA en cDNA Unir cDNA con nucleótidos fluorescentes Hibridarlo con la matriz Detectar y cuantificar fluorescencia utilizando un scanner laser Analizar los resultados

9 Impresión de MicroarraySíntesis previa

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11 Aislar el material que quiero estudiar…Extracción de RNAt o RNAm RNA A Extracción de RNAt o RNAm RNA B

12 Hibridación con la matrizRNA A RNA B RT con un nucleótido marcado con un colorante cDNA B cDNA A Hibridación con la matriz

13 Detector de fluorescencia

14 El detector envía TODOS los datos a una computadora

15 cDNA B cDNA A A y B La señal es proporcional a la cantidad de transcripto en la muestra original

16 Análisis de resultadosSIEMPRE se normalizan los resultados de los genes analizados con genes “housekeeping” (es decir, aquel que no debería variar de una muestra a otra)

17 Ventajas y desventajasPROS Permite analizar un gran número de genes al mismo tiempo en un sólo experimento Se puede observar nivel de expresión Permite comparaciones inter e intraespecies CONS No es una medida cuantitativa Se requiere conocimiento previo de la secuencia Alto costo Análisis muy riguroso y matemáticamente dificultoso

18 El análisis de los perfiles de transcripción, no es suficiente para explicar los cambios funcionales observados en la célula. Los resultados deben confirmarse con técnicas complementarias (Northern blot, Real Time-RT-PCR, Hidridación In Situ), lo que supone una labor adicional.

19 Otras aplicaciones del MicroarrayDetección de mutaciones y polimorfismos Secuenciación Diagnóstico clínico Screening y toxicología de fármacos Farmacogenómica (asociación entre perfil genético y respuesta terapéuticas a drogas) Toxicogenómica (evaluar cambios frente a sustancias tóxicas) Seguimiento de terapia Medicina preventiva Hibridación comparativa del genoma Inmunoprecipitación de la cromatina

20 GeneChip® sondas No se pueden procesar dos muestras a la vez

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37 GeneChip® en el desarrollo de vacunas

38 Chips microelectrónicos o Nanochip®

39 Macroarrays EXTRACCIÓN DE ARN ARNm a ADNcMARCACIÓN RADIOACTIVA DE ADNc HIBRIDACIÓN CON SONDAS FIJAS EN SOPORTE (NITROCELULOSA O NYLON) REVELADO VENTAJAS: MÁS BARATO, RESULTADO VISIBLE A SIMPLE VISTA DESVENTAJAS: UNA MUESTRA POR ARRAY, RADIOACTIVIDAD

40 Arrays de Tejidos o TMA Consiste en un bloque de parafina (soporte) que contiene hasta 1000 muestras de distintos tejidos tomadas de biopsias y dispuestas en forma ordenada y en una posición precisa.

41 Arrays de Tejidos o TMA

42 Técnicas para el estudio de expresión de genesHibridación Sustractiva SAGE ADNc – AFLP DDRT – PCR Arrays de ADN Tratamiento con bisulfito Northern Blot RPA Real Time PCR Hibridación In Situ Estudio de la expresión global Epigenética Expresión de genes específicos

43 Estudio de la metilación del ADN

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