1 Tecnologia da biologia celular e molecular aplicada a medicinaProf. Dr. Juscélio Clemente de Abreu

2 Introdução Ordem CronológicaOs conhecimentos sobre as células e suas moléculas progrediram paralelamente ao aperfeiçoamento dos métodos de investigação. Tecnologia e biologia sempre andaram juntas Ordem Cronológica Óculos (1268) - Roger Bacon constrói as primeiras lentes de cristal para corrigir distorções da visão. A invenção de Bacon demoraria mais 100 anos para se tornar prática.

3 Primeiro Microscópio (1590)Hans Janssen inventa o 1° microscópio, que inicialmente possuía apenas uma lente. Com este aparelho, Antony van Leeuwenhoek, fez pela 1ª vez a obs de glóbulos vermelhos no sangue, um avanço para a biologia celular Advento do termômetro (1592) - Galileu, inventou o termômetro porém não eram muito preciso, pois suas medições sofriam com fatores externos, como pressão atmosférica. Nos séculos seguintes, Fahrenheit e Kelvin aperfeiçoaram o termômetro Animação:

4 Funcionamento do coração (1628)- É o médico inglês William Harvey ( ) quem descobre que o órgão é um músculo que bombeia o sangue para o restante do corpo Origem do Termo "Célula“ (1667) - Robert Hook criou o microscópio composto (objetivas e oculares) e utilizou a palavra célula (compartimento vazio - pedaço de cortiça)

5 Descoberta dos microrganismos (1674)O “primeiro estudo” em relação aos microrganismos ocorreu em 1674, quando o holandês Antony van Leeuwenhoek pode observar em gotas de água de rio, pequenos objetos móveis, invisíveis a olho nu, os quais ele chamou de “animálculos”. Sua fascinação e sua curiosidade o levaram a observar com seu rudimentar microscópio esses seres encontrados em salivas, infusões de pimenta, fezes e até material removido de seus dentes. A importância e os estudos destes organismos progrediu lentamente, somente no século 19 com as pesquisas e descobertas de Pasteur.

6 Pesquisa com eletrodos (1809)- Luigi Rolando (médico e fisiologista) em 1809 fez experimentos sobre a função do cerebelo, aproximando eletrodos do cerebelo. Pesquisas com eletrodos foram importante para descoberta experimental da localização da função cerebral: a estimulação elétrica localizada.

7 Invenção do Estetoscópio (1816)- O estetoscópio foi inventado por René Laennec. É um aparelho utilizado na medicina, principalmente na cardiologia, para ouvir os batimentos cardíacos e sons no pulmão. Atualmente existem até mesmo estetoscópios eletrônicos. Genética (1865) - O monge austríaco Gregor Johann Mendel desenvolve a ideia de gene, ao estudar os diferentes variedades de ervilhas que nasciam de sucessivos cruzamentos.

8 Centrifugação (1894) - Em 1894, o engenheiro sueco Carl Gustaf Patrik De Laval realizou um de seus inventos mas importantes, o centrifugador, dando inicio ás centrifugações. De Laval projetou o centrifugador para separar a gordura do leite, sendo posteriormente modificado e ajustado para uso em outros produtos alimentícios bem como para atingir outros propósitos em que é utilizado hoje. Utiliza-se para separação de células de sangue e ainda outras funções como separação de DNA, RNA, precipitação de células em cultura, dentre muitas outras funções.

9 Descoberta do Raio-X (1895)- Foi por um acaso que, fazendo experiências com o tubo de raios catódicos, Wilhem Conrad Röntgen descobriu uma forma de radiação até então desconhecida, a qual nomeou Raio-X . Atualmente, devido aos avanços tecnológicos, fontes de raio-x são usadas na Biologia Estrutural, como na cristalografia de proteínas. Classificação sanguínea (1900) - Em 1900 surge a classificação dos tipos sanguíneos (A, B e O) descrita por Landsteiner, o grupo AB por De Costello e Starli. A partir dai as pessoas poderiam fazer transfusões com segurança. A descrição do sistema Rh foi posterior (1940), por Landsteiner e Wiener.

10 Descoberta das vitaminas (1920)- A descoberta efetiva das vitaminas data do início do século XX com fatores acessórios dos alimentos. Em 1906, o bioquímico inglês Frederick Gowland Hopkins demonstrou a existência desses fatores, e em 1911, o químico polonês Casimir Funk descobriu na casca do arroz um "fator anti-beriberi" (que hoje sabemos ser a vitamina B6 ou niacinamida), que era capaz de corrigir a doença experimentalmente em animais e seres humanos. Como a substância era uma amina, Funk a denominou de "vital amin" (ou amina vital), que acabou sendo abreviada para "vitamina",

11 Descoberta da Insulina (1921)- Em outubro de 1921, no laboratório de Mac Leod, em Toronto, o canadense Frederick Banting – junto com seu colaborador Charles Best – utilizando cães como cobaias, consegue isolar uma substância que se mostrava capaz de eliminar os sintomas do diabetes. - Inicialmente, o objetivo principal era proteger o paciente da descompensação aguda do diabetes e da cetoacidose. Depois, a atenção foi direcionada para a prevenção de complicações tardias, parcialmente por causa de uma diminuição na incidência de situações agudas, que eram algumas vezes fatais.

12 A descoberta dos antibióticos (1922)O primeiro antibiótico identificado pelo homem foi a penicilina. Alexander Fleming, bacteriologista do St. Mary's Hospital, de Londres, já vinha havia algum tempo pesquisando substâncias capazes de matar ou impedir o crescimento de bactérias nas feridas infectadas, pesquisa justificada pela experiência adquirida na Primeira Grande Guerra , na qual muitos combatentes morreram em consequência da infecção em ferimentos profundos e maltratados por falta de tratamento adequado. E em 1928 Fleming desenvolveu pesquisas sobre estafilococos, quando descobriu a penicilina. A descoberta da penicilina deu-se em condições peculiaríssimas, graças a uma sequencia de acontecimentos imprevistos e surpreendentes.

13 Primeiro Microscópio Eletrônico (1931)- No dia 9 de março de 1931, o físico alemão Ernst Ruska apresentou o microscópio eletrônico, instrumento hoje capaz de ampliar imagens de moléculas orgânicas em até 500 mil vezes.

14 Ultrassonografia (1940) A "Teoria do Som" foi publicada pela primeira vez em 1877, por um cientista inglês chamado Lorde Rayleigh. Este tratado praticamente inaugurou a física acústica moderna. Durante a Primeira Guerra Mundial, esta teoria foi posta em prática. A utilização de geradores de sons de baixa frequência facilitava a navegação submarina, permitindo a detecção de icebergs distantes até 5 quilômetros. Em 1940, o ultrassom foi utilizado pela primeira vez em medicina diagnóstica. Karl Theodore Dussik, neuropsiquiatra da Universidade de Viena, tentava localizar tumores e verificar o tamanho dos ventrículos cerebrais, através da mensuração da transmissão dos sons pelo crânio.

15 Máquina de Diálise (1943) - Em 1943, Willem Kolff cria a maquina de diálise. Uma máquina de diálise tenta imitar algumas das funções do rim. Uma delas é eliminar substâncias tóxicas do organismo através da urina.

16 Desfibrilador (1947) Equipamento utilizado na parada cardiorrespiratória com objetivo de restabelecer ou reorganizar o ritmo cardíaco. O primeiro equipamento foi elaborado através de Claude Beck em 1947 utilizado em intraoperatório (desfibrilação interna). Em 1956 o médico Paul Zoll elabora a teoria e equipamento da desfibrilação externa. Hoje, são utilizados equipamentos em Unidade de Emergência e UTI, com cargas monofásicas que variam de 0 a 360 Joules ou Bifásicas de 0 a 200 J. O DEA, Desfibrilador Automático Externo, é equipamento capaz de efetuar desfibrilação com leitura automática, independente do conhecimento prévio do operador.

17 Quimioterapia (1948) Quimioterapia é uma das mais importantes armas de que dispomos no tratamento contra o câncer; Ela surgiu durante a Segunda Guerra Mundial, nos Estados Unidos, quando as pessoas que trabalhavam em pesquisas com o gás mostarda (substância utilizada na guerra química) começaram a apresentar alterações nos glóbulos brancos, vermelhos e plaquetas e anemia. Isso chamou a atenção dos pesquisadores que passaram a estudar o assunto, porque há doenças em oncologia, como muitas leucemias e alguns linfomas, que evoluem com aumento dos glóbulos brancos (leucócitos) e queda dos vermelhos (hemácias).

18 Advento do marca-passo (1952)Em 1952 foi construído um aparelho que enviava choques elétricos através da parede torácica, provocando a construção cardíaca. Os inconvenientes desse primeiro marca-passo eram vários: os choques contraíam também a musculatura do tórax, trazendo sofrimento ao paciente. Em 1957 houve um aperfeiçoamento do marca-passo.

19 Descoberta do DNA (1953) - No dia 7 de março de 1953, no laboratório Cavendish, na Inglaterra, Francis Crick e James Watson concluíram que a molécula do DNA tem a estrutura de uma dupla hélice, uma descoberta que daria novos rumos à ciência.

20 Primeiro Transplante de Órgão Humano (1954)- O primeiro transplante de órgão humano foi registrado em 23 de dezembro de 1954, em Boston, nos Estados Unidos. O médico-cirurgião Joseph Murray fez o implante de rim entre irmãos gêmeos idênticos, que morreram alguns dias depois por causa da rejeição

21 Identificação de proteínas (1957)A primeira proteína foi decifrada em 1957 (mioglobina muscular). Ela foi identificada por John Cowdery Kendrew e Max Ferdinand Perutz. Atualmente, já foram identificadas milhares proteínas de diferentes organismos. A corrida ao grande mapa das proteínas, ou proteoma, será um dos maiores desafios científicos do século XXI Proteoma é o conjunto de proteínas expresso por um genoma, ou seja são as proteínas codificadas por um conjunto de genes de um organismo. O mapeamento de proteomas conta com técnicas desenvolvidas especificamente para analisar proteínas. Sua finalidade é estudar o conjunto, a estrutura e a função das proteínas.

22 Rejeição do transplante (1958)- Foi o francês Jean Baptiste Dausset quem explicou o problema da rejeição de órgãos transferidos de uma pessoa para outra. Ele percebeu que os glóbulos brancos dos pacientes – e não os vermelhos, como se acreditava – eram os responsáveis pela rejeição. Sendo assim, os pacientes teriam que sofrer uma espécie de redução do seu sistema imunológico para ter uma maior chance de sucesso. Seus estudos lhe renderam o prêmio Nobel e deflagraram, em dez anos, uma onda de transplantes de órgãos, entre eles, o coração. Rejeição aguda Rejeição crônica

23 Advento da endoscopia (1958)- Fibroendoscopia foi um grande progresso nos métodos diagnósticos porque substituiu os então utilizados aparelhos metálicos, rígidos e cheios de limitações. Em 1958, foi publicado o primeiro trabalho sobre a utilização de fibra óptica em endoscopia, resolvendo um dos problemas aparentemente insolúveis: o da curvatura da luz. A novidade possibilitou a obtenção das imagens antes não alcançadas. Vinte anos depois, a fibroendoscopia foi superada pela videoendoscopia.

24 Invenção do Laser (1960) Em julho de 1960 Maiman anunciou o funcionamento do primeiro laser cujo meio ativo era um cristal de rubi. A descoberta do laser, é um marco na história da humanidade. Essa fonte de luz, que permite associar características como a coerência, a elevada intensidade e o grande direcionamento do feixe emitido, possibilitou avanços nas telecomunicações, na indústria, na medicina, nas operações militares e na pesquisa científica das mais diversas áreas do conhecimento humano. Desde então as aplicações do laser em medicina crescem continuamente. Em 1964, Kunmar Pate empregou o laser de CO2 em cirurgia.

25 Tomografia Computadorizada (1964)- A tomografia computadorizada foi inventada pelo engenheiro eletrônico Godfrey N. Hounsfield, pela qual recebeu o prêmio Nobel em fisiologia e medicina em 1979, juntamente com o sul-africano naturalizado americano, físico Allan McLeod Cormack. Cormack desenvolveu em 1956 a teoria e a matemática de como múltiplos raios projetados sobre o corpo, em ângulos diferentes, mas em um único plano, forneceriam uma imagem melhor do que o raio único, usado na radiografia. Seus trabalhos foram publicados no Journal of Applied Physics, em 1963 e Sendo este um periódico de física, não era lido por radiologistas, e Hounsfield desenvolveu a teoria independentemente, e construiu o aparelho em 1964.

26 Primeiro Transplante de Coração Humano (1967)- Em 3 de dezembro de 1967, o cirurgião sul-africano Christiaan Barnard faz o primeiro transplante de coração humano. O paciente só sobreviveu 18 dias e morreu de infecção, mas pouco depois o cardiologista alcança o primeiro sucesso mundial com uma operação do gênero.

27 DNA recombinante (1974) O DNA recombinante é um DNA alterado, modificado, isto é, que teve alguns genes adicionados ou substituídos. É pelas técnicas do DNA recombinante que a Engenharia genética produz os TRANSGÊNICOS. No ano de 1974 os pesquisadores Werner Arber, Daniel Nathans e Hamilton O. Smith isolaram enzimas de restrição (normalmente produzidas por bactérias e que são capazes de cortar o DNA controladamente em determinados pontos). Juntamente com a ligase, que consegue unir fragmentos de DNA, as enzimas de restrição formaram a base inicial da tecnologia do DNA recombinante.

28 Primeiro Bebê de Proveta (1978)- Em 1978 nasce, na Inglaterra, o primeiro bebê de proveta, ou seja, bebê nascido através da fertilização in vitro, Louise Brown.

29 Microscópio de tunelamento (STM) - 1981Graças à invenção do microscópio de tunelamento (STM), passou a ser possível não só ver, mas medir e manipular átomos ou moléculas. O STM foi inventado por Gerd Binnig e Heinrich Rohrer, da IBM de Zurich, em 1981 e foi o primeiro instrumento capaz de gerar imagens reais de superfícies com resolução atômica. Em 1986 seus inventores ganharam o Prêmio Nobel de Física. Esses microscópio abriu o campo de estudos da nanotecnologia.

30 Desenvolvimento da Terapia gênica (1990)Terapia Gênica é o tratamento realizado em organismos através da inserção de genes “normais” em substituição à genes defeituosos, principalmente em tratamentos de doenças genéticas. A transferência de material genético para tratamento de doenças humanas vem sendo pesquisada desde o início da década de 70. No entanto apenas em 1990, com os avanços alcançados na biologia molecular, pesquisadores norte-americanos realizaram a primeira terapia genética autorizada. Para substituir os genes defeituosos, no entanto, é necessário um vetor que envie o gene terapêutico para as células, essa função é desempenhada por vírus geneticamente modificados, que ao invés de possuírem genes causadores de doenças, passam a carregar o gene terapêutico especifico.

31 Primeiro Mamífero Clonado (1995 – 1996)A ovelha Dolly foi o primeiro mamífero clonado por transferência nuclear de células somáticas. O Prof. Ian Wilnut, do Instituto Roslin, da Escócia, foi o pesquisador responsável por este experimento. O estudo foi publicado em 1997, mas foi realizado ao longo de 1995 e 1996. A ovelha Dolly nasceu em 05 de julho de O nome Dolly foi uma referência a cantora norte-americana Dolly Parton. O núcleo utilizado no processo de clonagem foi oriundo de uma célula da glândula mamária de uma ovelha de seis anos denominada Bellinda, da raça Finn Dorset.

32 Mapeamento do Genoma Humano (2001)- Em 2001, concluiu-se a decodificação do genoma humano. Atualmente, as pesquisas ainda se concentram em controlar o funcionamento das células através da manipulação do DNA. Em 14 de abril de 2003, o consórcio internacional que constituiu o Projeto Genoma Humano anunciou oficialmente a conclusão do sequenciamento dos 3 bilhões de bases do DNA da espécie humana.

33 Técnicas de análises da biologia celular e molecularMÉTODOS DE OBSERVAÇÃO Microscopia óptica Microscopia eletrônica MÉTODOS DE SEPARAÇÃO Fracionamento Celular Cromatografia, Eletroforese MÉTODOS DE DETECÇÃO Citoquímica Imunocitoquímica Radioautografia Hibridização in situ (FISH)

34 MÉTODOS DE OBSERVAÇÃO

35 Microscopia

36 Limites de Resolução

37 Amplitude do tamanho dos objetos observados em diferentes microscópios

38 Microscopia Óptica

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40 Microscopia de fluorescência

41 Os cortes para microscopia de fluorescência devem ser coradas através de técnicas de citoquímica e imunofluorecência.

42 Microscopia Eletrônica

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44 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)MET pode utilizar pigmentos de alto número atômico para realçar contraste. O pigmento absorve elétrons ou dispersa parte do feixe de elétrons projetado sobre o sistema de imagem. Compostos de metais pesados tais como o ósmio, chumbo ou urânio podem ser usados previamente à observação no MET. microvilosidades O MET possui sistemas de iluminação e vácuo que produz feixes de elétrons de alta energia, que ao incidir sobre uma amostra de tecido ultrafina, fornece imagens planas.

45 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)MEV é capaz de produzir imagens de alta resolução da superfície de uma amostra. Devido a maneira com que as imagens são criadas, imagens de MEV tem uma aparência tridimensional e são úteis para avaliar a estrutura superficial da amostra. células estereociliadas da cóclea Estereocilio das céls ouvido

46 MÉTODOS DE SEPARAÇÃO Centrifugação Cromatografia, Eletroforese.

47 Centrifugação Por centrifugação é possível obter organelas celulares em estado de pureza e em seguida estudar suas propriedades químicas, físicas e biológicas. Rompimento de células para obtenção de homogeneizado: ultrassom, detergentes, mecanicamente (pressão ou esmagamento) O homogeneizado é disperso em um meio líquido contendo sacarose (mantém a integridade dos componentes celulares e evita as organelas de se juntarem qdo a céls se rompem). O isolamento de uma organela através da centrifugação depende do seu coeficiente de sedimentação, isto é, do seu tamanho, forma e densidade da solução em que está sendo centrifugada.

48 Centrifugação de componentes celulares1) Centrifugação fracionada = uma série de centrifugações em aumento progressivo de velocidade. - Organelas maiores e mais densas sedimentam 1° e o sobrenadante é retirado e centrifugado de novo... E assim por diante até a obtenção do fração solúvel

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50 2) Centrifugação contragradiente = as partículas são separadas por suas diferenças de densidade. - O gradiente (solução de sacarose ou CsCl) tem concentração máx na parte profunda do tubo. - Logo após ter sido preparado o gradiente, coloca-se o homogeneizado sobre sua superfície e faz-se a centrifugação. - Cada tipo de partícula para no local onde há equilíbrio entre a força centrífuga da partícula e a concentração do gradiente.

51 S = unidade Svedberg: uma medida da taxa de sedimentação de um componentes em uma centrífuga, relacionando peso molecular e a forma 3-D do componente.

52 Cromatografia É um técnica de separação de compostos orgânicos diluídos (DNA, RNA, proteínas, aminoácidos...) Consiste no transporte dos componentes de uma amostra por uma fase móvel (compostos diluídos) através de uma fase estacionaria (solido poroso, resina de troca iônica, sílica gel ou gel polimérico)

53 Tipos de cromatografia

54 Cromatografia de coluna

55 Eletroforese 1) Eletroforese de Proteína

56 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)polyacrylamide persulfate + cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm) 7 a 15% [acrilamida] – maioria das proteínas Gradiente de acrilamida – aumenta poder de resolução

57 Proteína Ponto Isoelétrico Pepsina < 1.0 Ovalbumina (galinha) 4.6 Albumina Sérica (humana) 4.9 Tropomiosina 5.1 Insulina (bovina) 5.4 Fibrinogênio (humano) 5.8 g - Globulina 6.6 Colágeno Mioglobina (cavalo) 7.0 Hemoglobina (humana) 7.1 Ribonuclease A (bovina) 7.8 Citocromo c 10.6 Histona (bovina) 10.8 Lisozima (galinha) 11.0 Salmina ( salmon ) 12.1 Separação na eletroforese nativa é influenciada pela carga, massa e forma da molécula 18.000 64.000

58 desnaturação uniformiza a forma das proteínas;B C SDS (dodecil sulfato de sódio + 2-mercaptoetanol Efeitos do SDS desnaturação uniformiza a forma das proteínas; mascara a carga natural das proteínas no pH da corrida, fazendo com que todas moléculas migrem para o anôdo; facilita o efeito de redutores

59 Salmonella tiphymuriumSDS-PAGE Salmonella tiphymurium

60 Determinação da massa molecular de proteínas Curva de calibração de SDS-PAGE a 15% Mobilidade relativa (Rf) Massa molecular (kD) Mobilidade relativa = (distância percorrida pela banda X) ÷ (distância percorrida pelo marcador da corrida) 97.4 87.0 45.0 29.0 21.0 12.5 6.5 (-) (+)

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62 2) Eletroforese de Ácidos NucleicosCuba horizontal

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64 Enzimas de restrição e Reação em cadeia de polimerização (Polymerase Chain Reaction - PCR)Enzimas de Restrição (“Tesouras de DNA”) São encontradas nas bactérias para cortar o DNA de vírus que possam penetrar em seu citoplasma São proteínas que reconhecem e cortam o DNA em pontos específicos, geralmente em sequencias de 4 a 8 pares de bases, chamados palíndromos. Mais de 1000 enzimas de restrição já foram identificadas. A nomenclatura é a abreviação do nome da sp do microrganismo e da ordem da descoberta.

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66 Reação em cadeia de polimerização (PCR)Serva para sintetizar fragmentos de DNA in vitro Como é possível sintetizar fragmentos DNA in vitro? Através da descoberta da Taq DNA polimerase da Thermus aquaticus (bactéria) Usos de: - Oligonucleotídeos iniciadores (primers) - dNTP´s (desoxinucleotídeos: A, T, C, G) - MgCl2 (cofator enzimático) - Solução tampão - Termociclador (aparelho)

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72 MÉTODOS DE DETECÇÃO Citoquímica Imunocitoquímica Radioautografia

73 Citoquímica Estuda a localização intracelular das diversas substâncias que compõem as células. Pode ser aplicada em nível de MO e ME. Na MO o produto da reação citoquímica deve ser corado. Na ME o produto deve possuir elétron densidade. Algumas reações citoquímicas seguem a lei de Lambert-Beer = intensidade de cor é proporcional à concentração da substâncias em estudo nas céls e tecidos.

74 Demonstração citoquímicaA reação citoquímica é específica para o composto celular, que podem ser: Os ácidos nucléicos - reação de Feulgen. Os polissacarídeo e oligossacarídeo – Periódico ácido Schiff (PAS). Os lipídios – Sudan IV, Sudan back e Azul de Toluidina. Os íons - reações químicas. Proteínas – fosfatases. Citoquímica ultra-estrutural - sais de metais pesados.

75 Periódico ácido Schiff (PAS)Consultar Atlas colorido do Livro Histologia Básica – Junqueira e Carneiro para outros exemplos reação de Feulgen

76 Aplicação médica da radioautografiaMuitos procedimentos citoquímicos são usados em diagnóstico laboratorial. A reação de Perls para ferro, as reações de PAS-amilase para glicogênio e Alcian blue para glicosaminoglicanas são habitualmente aplicadas a biópsias de tecidos de pacientes em que se quer diagnosticar doenças em que se acumulam nos tecidos quantidades elevadas de ferro (por exemplo, hemocromatose, hemossiderose), glicogênio (glicogenoses), glicosaminoglicanas (mucopolissacaridoses) e esfingoupídios (esfingolipidoses).

77 Imunocitoquímica Localização intracelular de proteínas por reação antígeno-anticorpo. Localiza com precisão uma determinada proteína excluindo todas as outras Detecção direta ou indireta Uso de marcação do anticorpo: peroxidase, fluorescência, ferritina, ouro-coloidal Usadas em MO e ME

78 Anticorpos monoclonaisAntecedentes: Os anticorpos que surgem em um animal em resposta a único antígeno complexo são heterogêneos e formados por vários clones diferentes de linfócitos B cada um deles expressando e secretando, respectivamente, um tipo de anticorpo, capaz de reagir com um diferente epítopo do antígeno complexo. Estes anticorpos são denominados policlonais.

79 Método de Produção de Anticorpo MonoclonalEnvolve fusão celular (hibridização de células somáticas), entre um linfócitos B normal produtor de anticorpo e uma linhagem de mieloma. Os diferentes grupos (clones) de linfócitos produzirão anticorpos diferentes contra as várias porções do antígeno complexo. Cada clone pode ser isolado e cultivado isoladamente, de forma que os diferentes anticorpos contra o antígeno complexo podem ser coletados e separados. Tais linhagens celulares imortalizadas, produtoras de anticorpos e derivadas de fusões, são chamadas hibridomas. Os anticorpos que elas produzem são anticorpos monoclonais.

80 Método de Produção de Anticorpo MonoclonalClique

81 Há fundamentalmente duas técnicas usadas em imunocitoquimicaTécnica direta: anticorpo contra o antígeno complexo (monoclonal ou policlonal)

82 Técnica indireta: é mais sensível, mas requer mais etapas (é necessário produzir um antianticorpo)

83 Antígeno carcinoembriônico é uma proteína presente cm vários tumores malignos, principalmente da mama e intestinos. Esta fig é uma demonstração imunocitoquimica de antígeno carcinoembriônico em uma secção de um adenocarcinoma de intestino grosso. O anticorpo estava marcado com peroxidase, evidenciada pela cor marrom. Contra coloraçâo: hematoxilina.

84 Hibridização in situ fluorescente (FISH)

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86 Célula em metáfase que foi hibridado com uma sonda para a Deficiência de esteróide-sulfatase, causada por uma microdeleção no cromossomo X. - "X cen" - sonda centrômero do X. - "Xp22.3“- sonda da região da esteroide-sulfatase, no gene Xp Doença: Ictiose

87 Pele seca e escamosa - ictiose

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89 Radioautografia Uso de radioisótopos para seguir e localizar compostos dentro da célula Fornecimento de molécula marcada: trício 3H, carbono 14C, enxofre 35S Exposição a filme auto-radiográfico. Ex: Timidina marcada com trítio 3H para se localizar as células que estão sintetizando DNA. Desvantagem = uso de radioisótopos

90 Radioautograma de glândulas salivares submandibulares de um camundongo que foi injetado com 3H-fucose, 8 horas antes do sacrifício. Ao microscópio de luz se observam grãos negros de prata (setas), que indicam as regiões celulares que estão radioativas. A maior parte da radioatividade está localizada nos grânulos citoplasmáticos das células dos duetos glandulares. Aumento médio.

91 Aplicação médica da radioautografiaA cultura de células tem sido extensamente usada para o estudo do metabolismo de células normais e cancerosas e para o desenvolvimento de novos fármacos. Esta técnica também é útil para o estudo de microrganismos que só crescem no interior de células, como os vírus, o Mycoplasma e alguns protozoários . Em citogenética, a determinação do cariótipo (o número e morfologia dos cromossomos de um indivíduo) pode ser realizada pelo cultivo de linfócitos do sangue ou de fibroblastos da pele. Examinando células durante a divisão mitótica podem-se descobrir anomalias, no número e na morfologia dos cromossomos, que podem ser correlacionadas com numerosas doenças genéticas.