1 TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE.CAPITULO 15 TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE. Manipulación del DNA ENZIMAS DE RESTRICCION / MAPAS DE RESTRICCION VECTORES DE CLONACION - TIPOS GENOTECAS - TIPOS CLONACION IDENTIF. DE SECUENCIAS CLONADAS METODOS PARA EL ANALISIS DE SECUENCIAS: SOUTHERN/ NORTHEN/WESTERN PCR SECUENCIACION

2 BIBLIOGRAFIA Griffiths et al. (2000) Klug y Cummings (1999)Tamarin (1999) Strachan et al. (1996) Kaplan et al. (1993) wwwhttp://www.cbs.dtu.dk/dave/roanoke/genetics.html

3 ENZIMAS DE RESTRICCION* Nucleasa sintetizada por las bacterias como un mecanismo de defensa natural * Nucleasa capaz de reconocer y cortar una secuencia específica de nucleótidos en una doble cadena * Longitud de la secuencia reconocida de 4 a 8 bp * Reconocen secuencias palindrómicas Primera enzima descubierta fue a partir de Haemophilus influenzae

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5 EXTREMOS COEXIVOS

6 EXTREMOS ROMOS

7 Mapas de restricción

8 Mapas de restricción

9 VECTORES DE CLONACION . REPLICACION AUTONOMA. MAPA DE RESTRICCION CONOCIDO Un único pto. De corte . MARCADORES SELECTIVOS Resistencia antibióticos Cambios de color . RECUPERACION SENCILLA . TIPOS: Plásmidos, fagos, cósmidos, YACs, BACs, etc.

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15 BACs Polilinker Resistencia antibióticos Factor F de Bacterias:plásmido con replicación autónoma, que transfiere información genética durante la conjugación bacteriana Polilinker Resistencia antibióticos

16 CLONACION 1º Inserción del fragmento de DNA a clonar en un Vector de clonación: MOLECULA DE DNA RECOMBINANTE

17 CLONACION 2º Introducción mol. DNA recombinante en hospedador (bacterias) 3º Vectores se multiplican de forma autónoma 4º Bacteria se divide 5º Un gran nº de copias dará lugar a un clon, con muchas copias del fragmento

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19 GENOTECA . Clonación de todas las secuencias del genoma. Presente al menos una copia de cada gen . Nº de clones depende: - tamaño inserto - tamaño genoma . Tipos : genómicas, cromosómicas, cDNA ln ( 1-p) N : nº de clones N = P : Prob de recuperar ln ( 1-f) f: fracción genoma en el clon

20 ln ( 1-f) f: fracción genoma en el clonln ( 1-p) N : nº de clones N = P : Prob de recuperar ln ( 1-f) f: fracción genoma en el clon Genoma humano: 3,0 x 106 Kb P : 99% f : Inserto 17 Kb - 1,7 x 104 /3 x 109 N : 8.1 x 105 fagos Genoma humano: 3,0 x 106 Kb P : 99% f : Inserto 5 Kb N : varios millones plásmidos Genoma humano: 3,0 x 106 Kb P : 99% f : Inserto 50 Kb N : cósmidos

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24 1º PASO SOUTHERN BLOTTING 3º PASO 2º PASO 4º PASO 5º PASO

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29 1º PASO: DESNATURALIZACION

30 2º PASO: ANILLAMIENTO DE PRIMERS

31 3º PASO: ELONGACION

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33 Método de Maxan y GilbertSECUENCIACION Método de Maxan y Gilbert

34 Método de Maxan y GilbertSECUENCIACION Método de Maxan y Gilbert

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36 METODO DE SANGER 1º Paso: Desnaturalización 2º Paso: Adición de : dNTPs DNApolimerasa cebador 3ºPaso: adición de ddNTPs

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