1 Tema 3. Análisis estructural de enzimas.1.-Determinación de la Masa molecular. 2.- Determinación de la composición aminoacídica y estructura primaria. 3.- Estructura secundaria y terciaria. Determinación estructural: RMN, Cristalografia. 4.- Estructura cuaternaria. Determinación sub-unidades, tipo Funcionalidad

2 1.- Determinación de la Masa molecular.

3 Cromatografía por filtración en gel: Tamaño Técnicas cromatográficasLas proteínas se separan por exclusión molecular mediante el uso de bolitas porosas de un polímero insoluble como dextrano o agarosa (Sephadex, Sepharosa). Técnicas cromatográficas Se determina Vo con Blue Dextran Ve se determina para cada proteína Vt se calcula de la fórmula  r 2 x h Kav =Ve-Vo / Vt-Vo

4 Se generan iones de las proteínas y se aceleran a través de un campoEspectrometria de masas MALDI-TOF: matrix-assisted laser desorption-ionization-time of flight ESI: electrospray ionization mass spectrometry MALDI-TOF Se generan iones de las proteínas y se aceleran a través de un campo eléctrico. Se determina el tiempo que tardan en ser detectados que es función de su masa.

5 Resultado de una espectrometría de masas

6 Información del peso molecularPermite la conversión en concentración de proteínas en solución a Molaridad Composición: ¿cuántos aminoácidos de un tipo hay en la molécula? 2.- Actividad catalítica ¿cuántas moléculas de substrato son transformadas por una molécula de enzima por segundo? 3.- Uniones a ligandos ¿cuántas moléculas de ligando se une por molécula de enzima?

7 (R-CO-NH-R) para formar péptidos2.- Determinación de la composición aminoacídica y estructura primaria. Las proteínas son polímeros lineales formados por monómeros llamados aminoácidos Ayuda a conocer su mecanismo de acción. Identificación de regiones funcionales en una enzima 2. Interpretar datos estructurales cristalográficos, RMN. 3. La secuencia determina la estructura tridimensional Los aminoácidos se unen entre si mediante enlace covalente de tipo amida (R-CO-NH-R) para formar péptidos Las proteínas son polímeros lineales formados por monómeros llamados aminoácidos Enlace peptídico El equilibrio está más desplazado hacia la hidrólisis, por ello la formación del enlace requiere un aporte de energía (ATP). Sin embargo el enlace peptídico es cinéticamente muy estable y en ausencia de un catalizador, el tiempo de vida en disolución acuosa es de años.

8 Estructura primaria Enlace peptídicoCorresponde a la posición de cada aminoácido en la secuencia codificada por el ADN Cada proteína tiene una secuencia de aas única y definida con precisión Enlace peptídico

9 METODOS TRADICIONALES DE SECUENCIACIÓNComposición aminoacídica de cadenas polipeptídicas Identificación del extremo amino terminal Reacciones del grupo amino: - Reacción de Edman: Fenilisotiocianato. Absorbancia a 254nm - Reacción de Sanger: 1-fluoro,2,4 dinitrobenceno (FDNB). Ab. 360nm - Reacción con el cloruro de dansilo: compuestos fluorescentes. - Reacción con la ninhidrina o fluoroescamina. compuestos fluorescentes.

10 Reacción de EDMAN l: 254 nm Fenilisotiocianato

11 Degradación de EDMAN Hasta 50 residuos contiguos de un polipéptido

12 Rotura de puentes disulfurosPolipéptidos de gran tamaño 1. Romper la proteína en fragmentos por métodos químicos o enzimáticos 2. Romper puentes disulfuros 3. Purificar cada fragmento y secuenciarlo por Degradación de EDMAN 4. Determinar el orden de los fragmentos y dónde se localizan, si los hay, los puentes disulfuros. Rotura de puentes disulfuros

13 Métodos para fragmentar las cadenas polipeptídicas

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15 METODOS ACTUALES DE SECUENCIACIÓNSecuenciación MS-MS

16 Estructura secundaria3.- Determinación de la estructura secundaria y terciaria. Estructura secundaria Disposición regular y repetida del esqueleto de la cadena polipeptídica en una dirección determinada. No se tienen en cuenta las cadenas laterales F y Sólo se permiten los giros alrededor de los enlaces Ca-N y Ca-C El carácter parcial de doble enlace del enlace peptídico limita la capacidad de rotación del mismo Los ángulos de giro (ángulos de torsión) se denominan: (fi) f y (psi)y.

17 Los valores para los giros fi y psi están comprendidosEstructura secundaria Los valores para los giros fi y psi están comprendidos entre 180º y -180º

18 Estructura secundaria¿ Cuáles son los valores estéricamente permitidos ? Indica los valores de los ángulos fi y psi de conformaciones permitidas Plot de Ramachandran Las posibilidades de giro van a determinar en gran medida el plegamiento de las proteínas

19 Hoja b plegada a-Hélice Estructura secundariaEn principio un péptido puede adoptar muchas conformaciones diferentes según los ángulos phi y psi Adopta la más favorable desde el punto de vista energético: menores impedimentos estéricos menor repulsión electrostática Existen dos tipos de estructuras secundarias termodinámicamente favorables a-Hélice Hoja b plegada

20 Estructura secundaria: a-hélicePuente de H n y n+4

21 Estructura secundaria: a-hélicef: - 57º y: - 47º

22 Radicales hacia el exterior ESTRUCTURA SECUNDARIAEstructura secundaria: a-hélice Radicales hacia el exterior de la hélice NO PARTICIPAN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA

23 Restricciones para la formación de una a-hélice1- Repulsión o atracción electrostática entre aminoácidos cargados. 2- Volumen de los grupos R adyacentes. No podrían ir seguidos varios aminoácidos voluminosos. 3- Interacciones entre cadenas laterales de aminoácidos separados por 3 ó 4 residuos. 4- Presencia de prolina. X-Pro.

24 R3 de la cadena adyacente)Estructura secundaria: hojas-b Los puentes de H conectan un residuo con dos residuos de la cadena adyacente (grupo NH de R1 y el CO de R2 de la cadena adyacente y entre el grupo CO de R1 y el NH de R3 de la cadena adyacente) Las hojas antiparalelas son más estables por la alineación de los puentes de H

25 Proteína globular con alto contenido en estructura bConcanavalina A

26 Las diferentes estructuras secundarias co-existenen una misma proteína

27 Estructura secundaria: giros, codos o lazos bPermiten el giro de 180º en la dirección de las cadenas polipeptídicas Estabilizado por puentes de H entre el aa1 y el aa4 (aai e aai+3)

28 Estructura suprasecundariaAgrupaciones estables de estructuras secundarias frecuentes en las proteínas. Motivos estructurales Todo alfa Todo beta Alfa-beta Unidad aa Meandro b Barril b Unidades bab

29 Estructura supersecundaria o motivos- Hélice-vuelta-hélice. - Siete hélices transmembrana. - Mano EF. - Cremallera de leucina. - Horquilla b. - Meandro b. - Barril b - Dedo de Zn. Todo alfa Todo beta Alfa-beta - Motivo bab

30 Siete hélices transmembranaTodo alfa Dos a-hélices yuxtapuestas Interaccionan entre sí mediante cadenas laterales de leucina (cremallera de leucina) Dos a-hélices cortas. Siete hélices transmembrana bacteriorrodopsina Mano EF Proteínas de unión al ADN reguladoras de la transcripción (c-fos, c-jun) Presente en proteínas que se unen a calcio como calmodulina o troponina

31 Dos estructuras b adyacentes orientadas de forma antiparalelaTodo beta Horquilla beta Barril beta Dos estructuras b adyacentes orientadas de forma antiparalela Meandro b Proteína que se une al retinol humano

32 Proteínas de unión a ADNAlfa-beta Dedos de Zinc Estructuras alfas y betas unidas por un átomo de Zinc que interacciona con Cys e His Proteínas de unión a ADN

33 Dedo de Zn

34 Motivo bab

35 Estructura subterciariaDominio: Parte de la cadena polipeptídica que tiene un plegamiento propio e independiente del resto de la proteína (Unidad de plegamiento). La unión estable de varios motivos da lugar a los dominios. Frecuentemente asociado a una función específica. Proteínas de más de 200 residuos

36 Estructura subterciariaDominio Dominio Dominio Regiones de 100 a 150 aminoácidos

37 Disposición tridimensional de todos los átomos de una proteínaEstructura terciaria Disposición tridimensional de todos los átomos de una proteína Mioglobina

38 Interacciones covalentesEstructura terciaria Fuerzas que estabilizan la estructura terciaria Interacciones débiles • Iónicas (puentes salinos) • Hidrofóbicas • Enlaces de hidrógeno • Fuerzas de Van derWaals Interacciones covalentes Entre restos de Cys

39 RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR

40 Núcleos en diferentes ambientes resonaran a frecuencias de radiación distintas

41 Proteína con 55 aminoácidosB-sheet

42 Efecto de la proximidad de dos núcleosNOESY “Nuclear Overhause Enhancement Spectroscopy” Muestra pares de protones muy cercanos menor de 5 A Magnetización se transfiere

43 Proteína de 55 aminoácidosDiagonal Primera dimensión

44 Genración de proteínas marcadas 13C, 15N y 2HRMN en tres dimensiones

45 Dominio de dedo de Zn

46 CRISTALOGRAFÍA RAYOS XLongitud de onda igual longitud que el enlace covalente

47 Proteínas cristalizan en la configuración biológica activa

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49 Los electrones de los átomos dispersan los rayos XLa forma de dispersión dependen del ordenamiento atómico

50 Transformación de FourierMapas de densidad electrónica

51 4. Estructura cuaternariaHace referencia al ordenamiento de diferentes subunidades en una proteína multimérica Uniones no covalentes Interacciones débiles • Iónicas (puentes salinos) • Hidrofóbicas • Enlaces de hidrógeno • Fuerzas de Van derWaals

52 1. ¿Cuantas sub-unidades y de que tipo?Estudios de evaluación Peso Molecular Estudios de determinación de peso molecular. Agentes desnaturalizantes (Guanidina) Tipos y número de subunidades (precaución trazas de proteasas, al disociar las sub-unidades) Estudios de crosslinlinking Agentes químicos: Dimetilsuberimidato Desnaturalización SDS Págin 100 de Fundamentals Determinación Peso molecular SDS-PAGE 4X X X X

53 Alcohol DH Levadura 2 moles de NADH/mol ADH (Dímero) Estudios de uniones a ligandos Número de sitios de una enzima por un substrato indica el número de sub-unidades (Disposición de las sub-unidades) Alcohol DH Levadura moles de NADH/mol ADH (Dímero) Hígado moles de NADH/mol ADH (Tetramero) Estudios de simetria Estudios de Cristalografía Ejes de simetria Aspartato carbamoiltransferasa 6 unidades catalíticas y 6 regulatorias Estudios de identidad de sub-unidades Secuenciación N-terminal y C-terminal Espectrometría de masas de las sub-unidades

54 2.Enzimas oligoméricas: Funcionalidad1. Aumenta la posibilidad de regulación catalítica 2. Variaciones en la propiedades catalíticas Ej.Triptofano Sintasa Proteínas Multienzimáticas. 3. Estabilidad. Lactato DH 4. Generación de estructuras complejas con funciones biológicas. Economía información genética Proteasoma