1 TRADUCCION - Biosíntesis de ProteínasProteínas: arreglos de solo 20 aa en forma no azarosa Ribosomas: lugar de síntesis de proteínas 1960s polisomas, tRNAs Jacob y Monod Teoría del mensajero 1964s confirmación de mRNA intermediario informacional

2 Componentes principales sistema traducciónmRNA tRNA Aminoacil-tRNA sintetasa Ribosomas Factores proteicos

3 mRNA : - Secuencia codificante - 5' leader No traducible (5´UTR) - 3' trailer No traducible (3´UTR) - 5' cap and 3' poly (A) tail (eucariotas)

4 tRNA Y T D arm TyC arm L-shaped

5 Aminoacil-tRNA sintetasasUne los aa al correcto tRNA 20 enzimas diferentes Requiere ATP Reconocimiento del tRNA: puntos de contacto entre tRNA y sitio activo de proteína (1–5 sitios, muchas veces incluye anticodon)

6 tRNA Une un aa específico en la terminación 3´tRNAs isoaceptores con anticodones diferentes unen el mismo aa (varios codones para un aa) Hay varias especies de tRNA que pueden reaccionar con el mismo codon El anticodon hace apareamiento de bases con un codon de mRNA (o mas), la tercer base de codon con la primer base de anticodon puede aparear con otras bases además del apareamiento tradicional (Wobbling)

7 Ribosomas 4 sitios de binding mRNA-binding site A site (aminoacyl)P site (peptidyl) E site (exit) 60S subunit 40S subunit Procariotas : subunidades 30s y 50s

8 Traducción 3 fases Iniciación Elongación Terminación y Reciclado

9 Disociación de ribosomas en subunidades INICIACION Procariotas Eucariotas -Tanscripción- traducción acopladas Iniciación citoplasmática Iniciación en mRNAs que se están transcribiendo -Reconocimiento de sitio de iniciación Estrategias diferentes para por interacción mRNA-RNAr reconocimiento de sitio de (Secuencia Shine-Dalgarno) iniciación 5´-UAAGGAGGU-3´ Traducción Cap-dependiente “scanning” Traducción Cap-independiente (IREs) -3 Factores de iniciación (IF1,IF2,IF3) factores diferentes Tienen en común Disociación de ribosomas en subunidades Formación complejo preiniciación en subunidad menor Unión de complejo preiniciación a mRNA Iniciación mediada por factores

10 Mecanismos de iniciaciónINICIACION Mecanismos de iniciación Iniciación cap dependiente y cap independiente cap-dependiente (Kozak, M 1978) - Reconocimiento m7G-cap en extremo 5´ Unión de subunidad 40s scanning hasta AUG iniciador *Leaky scanning *Ribosoma Shunting *Reiniciación cap-independiente (1988-Picornavirus) Unión directa de subunidad ribosomal 40s en sitio interno sobre mRNA denominado IRES

11 INICIACION cap dependienteEUCARIOTAS INICIACION cap dependiente 3 Pasos 1) Formación del complejo de preiniciación 43 S Unión del iniciador tRNAiMet a la subunidad menor 2) Unión de complejo 43 S a mRNA 3) Localización codón de iniciación (scanning) 4) Unión de la subunidad mayor del ribosoma Cada uno de los pasos de la iniciación de la traducción es facilitado por por proteínas denominadas Factores de iniciación.

12 Iniciación

13 Iniciación eIF4F eIF4E eIF4G eIF4A

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15 Interacción entre factores y regulación de iniciaciónInteracción entre cap y poli A Sinergismo que estimula inicio de traducción- circularización de mRNA

16 Reconstitution of the eIF4E/GST-4G1f/Pab1p Complex(A) Reconstitution with Pab1p immobilized on poly(A)-Sepharose resin. Pab1p bound to poly(A)-Sepharose resin was incubated with the indicated GST-4G1f proteins and eIF4E. Bound proteins were eluted with buffer containing SDS, resolved by SDS–PAGE, and visualized by Western analysis with the appropriate antibodies. (B) Reconstitution with eIF4E immobilized on the cap-analog resin 7mGDP-agarose. eIF4E bound to the resin was incubated with the indicted GST-4G1f proteins and Pab1p/poly(A)125 complexes. Bound proteins were analyzed as in (A).

17 If the dsRNA is incubated with GST-4G1f-459, Pab1p, and eIF4E (D), most of the dsRNA is linear although some circles are observed (lower left corner). In the presence of GST-4G1f, Pab1p, and eIF4E (E and F), much of the dsRNA is in a circular conformation with a protein complex positioned where the ends of the RNA meet. Differences in the apparent width of the RNA result from variation in the tip and imaging force used to generate each image

18 Ribosome-recycling

19 Scanning CODON INICIACION AUG codon iniciación predominante en eucariotas y exclusivo en levaduras AUG mas próximo a 5 ´es iniciación en mayoría de mRNAs - Secuencia que rodea el AUG es critica : Pu X X A U G Pu C C Pu C C A U G G Presencia de estructura 2ª downstream AUG aumenta iniciación a partir de ese sitio Factores eIF1, eIF5 ,eIF2 importantes en reconocimiento de AUG Estructura secundaria del 5´leader mRNA (puede impedir unión y/o scanning de los ribosomas)

20 Esquema del fundamento del método de toeprintingEstrella: primer de oligonucleótidos marcado radiactivamente. Flecha entera: RNAm. Flecha punteada: extendido por la transcriptasa reversa.

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22 Mecanismos no clásicos de IniciaciónINICIACION Mecanismos no clásicos de Iniciación Leaky scanning : AUG en contexto débil , carente de Pu en –3 y G en +4 2 proteínas diferentes == N-terminal == secuencias enteras Reiniciación: Comienza y termina la traducción a partir de un uORF. La subunidad 40s queda unida al mRNA se recarga de factores y comienza la traducción en el siguiente AUG.

23 Leaky scanning CUG, GUG, UUG codones de iniciación rarosAUG CUG, GUG, UUG codones de iniciación raros Codones = a AUG son usados como sitios iniciación suplementarios CUG upstream es usado a veces, 1er AUG siempre

24 D F The autoradiograms show [35S]Met-labeled proteins synthesized in vitro from capped mRNAs that encode chloramphenicol acetyltransferase. (A) Initiation at AUG#1 generates an N-terminally extended protein, labeled preCAT. A suboptimal context around AUG#1 allows some ribosomes to scan past that site and initiate instead at AUG#2. This leaky scanning produces a shorter protein, labeled CAT. (B) All mRNAs have a suboptimal context (U in position −3) around the first AUG codon and, except for the control in lane 1, a moderately stable base-paired structure between the first and second AUGs. The only variable is the distance (n) between AUG#1 and the base of the hairpin structure. When properly positioned, the downstream base-paired structure apparently suppresses leaky scanning (lane 4). A full description of these constructs and the adjustments required for the rabbit

25 Reiniciación AUG AUG uORF uORF: ORF presente en región 5´UTR

26 Factor de transcripciónC/EBP

27 cap-independiente IRES Internal ribosoma entry sites IRES : Zonas con estructuras complejas (5´UTRs) Poca similitud en cuanto a secuencia y tamaño. Su actividad depende de integridad estructural. Se definen funcionalmente Inicialmente se descubrieron en Virus 3-5% mRNAs celulares se traducen por mecanismo cap-independiente IRES presentes en 5´UTR

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30 GCMV IRES

31 RNA secondary structure model of the FGF-2, 5´-ATR

32 Ensayo plásmido bicistrónico

33 FIG. 2. The BCL-2 5-UTR functions as an IRES in vitroFIG. 2. The BCL-2 5-UTR functions as an IRES in vitro. The DNA constructs depicted (panel A) were transcribed in vitro in the presence of the m7G cap analog, then translated in nucleased RRL, and resolved via SDS-PAGE and autoradiography.

34 Regulación de iniciación de traducciónNiveles de regulación: Estructura de mRNA: Accesibilidad de cap uORFs y ORF dentro de secuencia codificante Contexto de AUG Estructura secundaria de mRNA 2) Actividad y Fosforilación de factores de iniciación 3) Interacciones Proteína-RNA 4) Interacciones RNA-mRNA

35 Actividad y Fosforilación de factores de iniciación Regulación de unión de subunidad 40S al mRNA Proteínas 4E-BPs: NO Fosforiladas ………..interacción con eIF4E Traducción Fosforiladas………… no interacción con eIF4E………… Traducción PI3-K, Akt y FRAP/mTOR (quinasas involucradas en fosforilación) b) Disponibilidad de eIF4E y fosforilación eIF4E poco abundante y limitante. Fosforilación en Ser Traducción Fosforilación de eIF4E en Ser 209 inhibe unión a cap si ocurre previo a interacción cap-eIF4E y estimula si ocurre después de interacción cap-eIF4E. MNK1 (quinasa)

36 c) eIF4G: Clivaje y disponibilidadEn apotosis o infecciones virales por proteasas Traducción b) eIF2 fosforilación eIF2-P (Ser51) Mayor afinidad por GDP ……………………. Traducción

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38 Proteínas 4E-BPs

39 eIF4E fosforilación

40 eIF4G: Clivaje y disponibilidadFIG. 1. Shutoff of host protein synthesis and cleavage of eIF4GI and eIF4GII upon poliovirus infection. (A) Pattern of protein synthesis. HeLa cells were mock-infected or infected with poliovirus (100 pfu per cell), and labeled for 30 min with [35S]methionine at the indicated times after infection, and equal amounts of cytoplasmic protein extracts (5 mg) were subjected to SDSy15% PAGE. The arrows indicate viral capsid proteins. (B and C) Analysis of eIF4GI and eIF4GII cleavage. Proteins (40 mg) of samples as in A were resolved by SDSy6% PAGE, transferred to nitrocellulose paper, and incubated with a polyclonal antibody against the N-terminal fragment of eIF4GI (B) or eIF4GII (C)

41 Regulación traduccional durante el estrés celularDisponibilidad del complejo ternario eIF2-P (Ser51) Mayor afinidad por GDP Inhibe traducción general

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43 Regulación de traducción de GCN4GCN4 : activador transcripcional (biosíntesis de aa) en levaduras [aa] GCN2 kinasa eIF2a P GCN4 traducción general

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45 Reiniciación

46 Interacciones Proteína-RNARegulación expresión genes involucrados en metabolismo de hierro (ALA, TfR, mitocondril aconitase;etc) Proteínas (IRP) que se unen a IRE: iron responsive elements (hairpin) en 5´o 3´UTR Evita degradación Inhibe interacción 4G-3F Inhibe interacción 4G-3F

47 ELONGACION eEF1A y eEF1B Fosfoproteínas (CK2 yPKC) eEF2 Fosfoproteínaaa-tRNA:EF1A:GTP EF1A:GDP EF1B EF2:GTP EF2:GDP eEF1A y eEF1B Fosfoproteínas (CK2 yPKC) eEF2 Fosfoproteína (eEF2 quinasa Inhibe actividad)

48 TERMINACION La estructura de RF1 se asemeja a la del tRNAAAAAAAAAAAA Poli(A) eIF4G PABP RF3 RF1 stop start 5`-cap Complejo de iniciación mRNA Complejo de terminación RF3-GTP RF3-GDP La estructura de RF1 se asemeja a la del tRNA

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50 Silenciamiento génico post-transcripcional por siRNA o miRNA